[发明专利]高效液相色谱-串联质谱法同时测定细菌群感效应AHLs类分子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体为一种细菌群体感应分泌AHLs类信号分子的测定方法。

背景技术

信号分子（N-酰基高丝氨酸内酯，N-acyl-homoserine lactones,简称AHLs）又称自诱导剂，是微生物之间发生群体感应效应(Quorum sensing)的关键物质，微生物通过信号分子的分泌、释放、感应进行种内及种间的相互交流并完成某种特性的表达。群体感应效应是指微生物细胞通过相应的感应系统感应细胞外的小分子自诱导剂的浓度，从而感知菌群密度的大小。当菌群密度达到一定的阈值时，激活一系列的目的基因并表达相应特性的方式。研究发现，很多细菌中都存在着类似的机制，例如革兰氏阴性菌所释放的AHLs类信号分子与其弹性蛋白酶、绿脓菌素、鼠李糖脂等的含量、凝集素及溶血素等因素有关。

目前，对细菌信号分子的分析方法包括薄层层析与细菌生物感应器相结合(TLC-Biosensor)的方法，GC-MS法及HPLC-MS法。其中TLC-Biosensor法目前广泛采用，但不同的细菌生物感应器对不同酰基侧链长度的AHLs敏感性不同，如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)对酰基侧链C-3羰基取代的AHLs敏感性最强，而紫色杆菌（chromobacterium violaceum CVO26）对短链的C-3没有取代基的AHLs比较敏感，因此不能准确地定性AHLs的种类，此方法也无法进行精密的定量分析。GC-MS及HPLC-MS的分析技术发展较快，能够对细菌所释放AHLs进行定性分析，但其在混合进样及微量定量分析上无法满足实验的需求。目前，有关HPLC-MS/MS对AHLs类信号分子进行定性及定量分析的研究鲜有报道，Daniele Morin等利用HPLC-MS/MS对AHLs类信号分子进行了分析，但其检测方法分析时间较长（约为40min），操作繁琐，灵敏度低。本研究使用HPLC-MS/MS，采用MRM模式，可在低浓度领域快速同时定性，定量11种信号分子，并在实际应用中对铜绿假单胞菌培养液中AHLs类信号分子进行了定性与定量的分析。

发明内容

本发明旨在提供一种分析方法，能同时测定细菌群体感应分泌的11种AHLs类信号分子。

技术方案为，一种高效液相色谱-串联质谱法同时测定细菌群感效应AHLs类分子的方法，包括如下步骤：

待测样品加入高效液相色谱串联质谱联用仪中，梯度洗脱；

所述的洗脱条件为：用A相和B相液体进行洗脱，所述的A相液体为含有10mmoI/L乙酸铵，0.2%甲酸的甲醇；所述的B相液体为含有10mmoI/L乙酸铵，0.2%甲酸的水溶液；

梯度洗脱的参数为：0min：A相20%、B相80%，瞬间达到设定的比例；0～8min，两种流动相均速变化到A相100%、B相0%；8～10.1min，A相100%、B相0%；10.1min时，瞬时调整为A相20%、B相80%；再以这个比例洗脱至15min；上述均为体积百分比。

用电喷雾离子源正离子模式，多反映监测模式，外标法进行质谱定量分析。

所用的色谱柱为C18柱；所述的色谱与质谱条件为：流速0.15～0.25mL/min；进样量:8～20μL；分析时间:15min；柱温:24～26℃。

更优选的，所述的色谱与质谱条件为：流速0.2mL/min；进样量:10μL；分析时间:15min；柱温25℃。

本发明利用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS），建立了同时测定细菌群体感应分泌的11种AHLs类信号分子的分析方法。细菌所分泌AHLs类信号分子经乙酸乙酯萃取后简单处理，可直接进样分析。本方法使用Phenomenex公司Luna C₁₈色谱柱（2.0mm×100mm，3μm），甲醇和水（10mmol/L乙酸铵，0.2％甲酸）梯度进样，采用电喷雾离子源正离子模式，MRM模式，外标法进行质谱定量分析。分析时间为15min。本方法在1～500ng/L浓度范围内呈良好的线性关系（r＞0.998），最低检出限为0.1ng/L～1.0ng/L，定量限为0.3ng/L～3.0ng/L。平均添加回收率为78%～99%，相对标准偏差2.8%～11.2%。本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度高的优点，适用于多种AHLs类信号分子化合物的同时定性、定量分析，为微生物群体感应的进一步研究提供了有效的，便利的分析方法。