[发明专利]一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法

权利要求书

1.一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，包括：

（1）比较草菇单孢分离菌株交配型A位点的基因序列，分析序列的保守性，针对草菇不同的单孢分离株分别设计特异性引物并合成；

（2）将上述草菇单孢菌株接种于PDA平板培养基，32~34℃培养；挑取草菇菌丝，利用试剂盒检测菌株交配型基因类型；

（3）把上述已确定交配型基因类型的草菇单孢菌株分别接种PDA平板培养基上，32~34℃下培养5~7d，在菌丝生长的部位打孔，把不同的单孢菌株两两接种在PDA平板培养基上，相距1厘米，32~34℃培养，两个菌落相交时，分别从两个菌落的外侧挑取菌块转移到PDA试管培养基上，32~34℃培养，3次继代培养；

（4）采用步骤（1）中的交配型基因的特异性引物对草菇杂交获得的菌株进行PCR扩增，草菇杂交菌株能扩增出针对两个母本的交配型基因的两条条带，单孢菌株只能扩增出一条条带，即可筛选出草菇杂交菌株。

2.根据权利要求1所述的一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的草菇单孢分离菌株交配型为A1或A2，A位点的基因序列分别如SEQ ID No.1所示或如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2所述的一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，其特征在于：所述A1对应的特异性引物为A1F：AGGGCATTCCAACCTATTCGCTTTC；

A1R：AATGTGAACAGTTTGAGCGGAGT。

4.根据权利要求2所述的一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，其特征在于：所述A2对应的特异性引物为A2F：CACTATCTCCTTGCGTTTGTTATG；

A2R：ATAACCAAACGCCAGAAACACTA。

5.根据权利要求1所述的一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，其特征在于：所述步骤（2）和（3）中的PDA平板培养基的组成为：马铃薯200g切片煮汁滤液，加入葡萄糖20g，琼脂20g，用水补足体积到1000mL。

6.根据权利要求1所述的一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的试剂盒为Phire Plant Direct PCR Kit试剂盒。

7.根据权利要求1所述的一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的PDA试管培养基的组成为：马铃薯200g切片煮汁滤液，加入葡萄糖20g，琼脂20g，用水补足体积到1000mL。

8.根据权利要求1所述的一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的PCR扩增反应条件为：

扩增体系:2×PCR buffer 10μL，Phire Hot Start II DNA Polymerase0.4μL，10μmol/L草菇菌株检测专用引物对各1μL，菌丝体稀释液0.5μL，ddH₂O7.1μL；PCR反应条件：98℃2min；98℃5s，67℃5s，72℃20s，40个循环；72℃10min。