[发明专利]一种脉动培养细菌纤维素的方法

权利要求书

1.一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征是：在细菌纤维素培养过程中，将中空透氧模具置入培养容器中，并在中空透氧模具内部充入气体，周期性地改变中空透氧模具中气体压力，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化。

2.根据权利要求1所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的中空透氧模具是由透氧材料根据所需修复的人体组织的实际形状、直径以及大小制作得到的；所述的中空透氧模具在外形上与人体乳内动脉、隐静脉、尿道、十二指肠或胆管的形状一致。

3.根据权利要求2所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的透氧材料是指在常温常压下的氧气透过速率为100～1000mL.m^-2.s^-1，孔隙均一度偏差<±0.3的材料。

4.根据权利要求2或3所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的透氧材料是指通过针织、机织或编织的方法将棉、纱、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维和/或PET纤维制成的中空多孔材料，或通过模具一次成型将硅橡胶、膨体聚四氟乙烯、乳胶或陶瓷透氧材料制成的中空透氧支架。

5.根据权利要求1所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的气体是指氧气体积浓度在10～100%范围内的气体。

6.根据权利要求1所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的周期性地改变中空透氧模具中气体压力是指气体压力在设定下限与设定上限之间交替转换，设定上限最大不超过1.5个标准大气压，设定下限最小不低于1个标准大气压，转换频率为65～165次/分钟。

7.根据权利要求1所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的交替转换的方法是指充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限；或者是指不断交替充入设定上限和设定下限压力的气体。

8.根据权利要求1所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化的外径形变量不超过5%。

9.根据权利要求1所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1）发酵培养液的调配；

发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2～5，蛋白胨0.05～0.5，酵母膏0.05～0.5，柠檬酸0.01～0.1，磷酸氢二钠0.02～0.2，磷酸二氢钾0.01～0.1，余量为水；

发酵培养液的pH为4.0～6.0；

将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；

2）菌种扩培；

将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×10⁵～2×10⁷个/ml；

3）静置培养；

将扩培后的菌液转移至灌满发酵培养液，内部有中空透氧模具的培养容器中，放置于恒温培养箱中，28～32℃静置培养；

通过在培养过程中向中空透氧模具充入空气，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化来实现脉动培养细菌纤维素；

所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化为两种情况之一：

（1）不断交替改变气体发生装置输出气体的压力设定上限和压力设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；

（2）充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；

所述的气体发生装置为氧气钢瓶、压缩空气钢瓶或气泵；

所述的脉动培养细菌纤维素为以下三种情况之一或之二或之三：

Ⅰ）脉动培养疏松层：

a.气体发生装置输出气体压力设定上限在小于1.2个标准大气压，不低于1.1个标准大气压范围内；气体压力设定下限在大于1个标准大气压，不超过1.1个标准大气压范围内；不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65～165次/分钟；气体中氧气体积浓度在10～15%范围内；

b.充入设定上限压力在小于1.2个标准大气压，不低于1.1个标准大气压范围内的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力在大于1个标准大气压，不超过1.1个标准大气压范围内；放气频率为65～165次/分钟，气体中氧气体积浓度在10～15%范围内；

制得的疏松层的纤维素含量为0.1×10^-2～0.2×10^-2g/cm³，厚度为1～5mm；

Ⅱ）脉动培养弹性层：

a.设定气体发生装置输出气体压力上限在小于1.5个标准大气压，不低于1.3个标准大气压范围内，气体压力下限在大于1.1个标准大气压，不超过1.3个标准大气压范围内；不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65～165次/分钟；气体中氧气体积浓度在30～50%范围内；

b.充入设定上限压力在小于1.5个标准大气压，不低于1.3个标准大气压范围内的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力在大于1个标准大气压，不超过1.3个标准大气压范围内；放气频率为65～165次/分钟，气体中氧气体积浓度在30～50%范围内；

制得的弹性层的纤维素含量为0.3×10^-2～0.6×10^-2g/cm³，厚度为1～5mm；

Ⅲ）脉动培养致密层

a.设定气体发生装置输出气体压力上限在小于2.0个标准大气压，不低于1.5个标准大气压范围内，气体压力下限在大于1.3个标准大气压，不超过1.5个标准大气压范围内；不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65～165次/分钟；气体中氧气体积浓度不低于50%；

b.充入设定上限压力在小于2.0个标准大气压，不低于1.5个标准大气压范围内的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力在大于1个标准大气压，不超过1.5个标准大气压范围内；放气频率为65～165次/分钟，气体中氧气体积浓度不低于50%；

制得的致密层的纤维素含量为0.7×10^-2～1.0×10^-2g/cm³，厚度为1～5mm；

4）后处理

脉动培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为1～10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2～10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。

10.根据权利要求9所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的菌种是指能够生物合成纤维素的微生物，包括：木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种；所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述发酵培养液置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温；所述的通纯氧是指将医用氧以1L/min的速度通入上述的培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4℃下试管中的菌种，并转移至上述的发酵培养液中；所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养液于28～32℃下摇床培养8～24小时。