[发明专利]镰刀菌特异单链抗体及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及镰刀菌特异单链抗体，还涉及镰刀菌特异单链抗体的制备方法，还涉及镰刀菌特异单链抗体在检测镰刀菌中的应用。

背景技术

镰刀菌（Fusarium）是世界范围内广泛存在的赤霉病病原真菌，能够侵染小麦（Triticum aestivum）、大麦（Hordeum vulgare）、燕麦（Avena sativa L.）、玉米（Zea mays L.）、水稻（Oryza sativa）、黑麦（Secale cereale L.）等多种禾谷类作物，严重影响作物的生长发育状况及籽粒质量，或产生直接危害人畜健康的真菌毒素，引起各种急性或慢性疾病，从而造成严重的经济损失。镰刀菌侵染作物引起的各种病害是我国小麦、玉米和水稻等主要粮食作物生产上的重要病害，特别是在我国长江流域、华中、华南及东北小麦玉米种植区流行频繁，近年来已有向黄淮区扩展蔓延之势。调查也显示我国的主要粮食作物籽粒均不同程度受到镰刀菌及其产生的真菌毒素的污染。因此，监控镰刀菌的污染情况，有利于防止田间病害的大面积发生，也可控制真菌毒素进入食品或饲料中。串珠镰刀菌（F. verticillioides）是一种非常重要的镰刀菌，主要侵染玉米，引起穗腐和粒腐，产生有毒的伏马菌素（Fumonisins）、串珠镰刀菌素（Moniliformin）、镰刀菌素C（Fusarin C）和镰刀菌酸（Fusarinic acid）等真菌毒素。所以本发明选用串珠镰刀菌作为原始材料制备抗原。

目前用于检测镰刀菌的方法主要是生物方法和分子检测，但这些方法需要在检测前先培养真菌，样品处理过程繁琐，费时费力。此外，这些方法对技术人员和专业设备的要求也使得其难以在野外或偏远地区开展检测工作。酶联免疫吸附法（ELISA）检测除了具有很高的特异性和检测限外，还能高通量快速开展工作，不受地域和设备的限制，易于推广使用。传统的免疫学检测需要将酶或荧光染料标记到一抗或二抗上，用于ELISA检测与抗体化学交联最常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。但是，由于化学交联是一个随机的反应过程，所以有可能导致活性降低或完全失活，也可能产生抗体-抗体或酶-酶等非特异交联物。因此，需要专业的技术人员、复杂的操作和最优的反应条件来保证获得高质量的抗体-酶交联物。生物技术的发展使得这一策略发生了根本性的改变，通过基因工程技术构建表达单链抗体-碱性磷酸酶（scFv-AP）融合蛋白，被认为是快速免疫学检测的一个很好的选择。ScFv-AP融合蛋白通过原核表达系统高效表达纯化后用于抗原检测，不需要添加酶标记二抗，从而使免疫学检测的效率明显提高，而检测费用则大幅降低，应用前景十分广泛。本发明通过构建免疫抗体基因文库，利用噬菌体抗体库技术筛选获得镰刀菌特异单链抗体，再通过基因工程技术手段将单链抗体与AP在基因水平上进行融合，原核表达的scFv-AP融合蛋白可为检测和调查玉米等粮食作物、饲料以及食品或制品中镰刀菌的污染情况提供快速可靠的检测手段。

发明内容

本发明目的在于提供了一种镰刀菌特异单链抗体基因，从串珠镰刀菌菌丝中抽提细胞壁蛋白（SCWPs），免疫来亨母鸡后提取脾脏细胞，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，再通过噬菌体展示技术筛选、Phage ELISA和表达ELISA鉴定，并进行序列测定，最后获得一个高亲和力的镰刀菌特异单链抗体及其编码基因，申请人将其命名为FvSG7。该基因由810个核苷酸组成，其序列为SEQ ID NO：1所示。重链可变区V_H由372个核苷酸组成，其序列为SEQ ID NO：3所示。轻链可变区V_L由315个核苷酸组成，其序列为SEQID NO：5所示。

本发明的另一个目的是在于提供了一种镰刀菌特异单链抗体，其序列为SEQ ID NO：2所示，由269个氨基酸组成，本发明的镰刀菌特异单链抗体主要由抗体重链可变区V_H、抗体轻链可变区V_L和连接肽组成，抗体重链可变区V_H和抗体轻链可变区V_L通过连接肽(Gly₄Ser)₃连接共同完成镰刀菌的识别和结合。其重链可变区V_H由124个氨基酸组成，序列为SEQ ID NO：4所示，轻链可变区V_L由105个氨基酸组成，其序列为SEQ ID NO：6所示。

本发明的另一个目的是提供了一种镰刀菌特异单链抗体在检测镰刀菌中的应用。