[发明专利]一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤模型的建立方法，具体地说是一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法。

背景技术

临床上常见的部分良性肿瘤具有易复发或多发的特性，手术过程中的不慎操作，往往会造成术后肿瘤沿手术切口呈串珠状种植性生长。术后肿瘤的种植性生长及复发给患者的生理和心理上带来极大的创伤和痛苦；多次复发还可能导致肿瘤恶变，尤其是发生于口腔颌面部的某些良性肿瘤，如人涎腺多形性腺瘤，WHO将其定义为临界瘤，由于其发生部位的特殊性，也给再次手术带来困难，严重影响了患者的生存质量。

目前国内外学者对人涎腺多形性腺瘤进行的研究，其研究对象多局限于离体标本，主要是对肿瘤的临床流行病学、病因学、病理学、分子生物学以及手术方式的改进、基因治疗方面的研究与探索。

有学者通过将人涎腺多形性腺瘤的组织块移植至裸鼠背部皮下，以试图建立移植瘤动物模型，但所建立的动物模型存在组织块消失和退化的缺点，因而未能在研究中大量应用。也有学者通过转基因技术制备了人多形性腺瘤PLAG1转基因小鼠模型，由于其为转基因技术制备的动物模型，虽然转基因小鼠颌下腺肿瘤模拟了人类多形性腺瘤，但在肿瘤的组织发生上与人多形性腺瘤有较大差异，组织学表现上也存在差异，甚至在肿瘤发生晚期阶段出现恶变倾向。由于目前存在涎腺多形性腺瘤细胞培养困难、活体组织模型建立更加困难的问题，致使肿瘤的组织及形态发生机理、种植或复发机理难以取得突破性进展。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，以解决目前人涎腺多形性腺瘤不能建立活体组织模型的问题，为难以进行活体研究的良性肿瘤研究提供一种活体组织模型。

本发明是这样实现的：一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，包括以下步骤：

（1）材料与试剂的制备：

培养液Ⅰ：取少量RPMI-1640培养液，加入15-20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素，混匀，加RPMI-1640补至100ml；

培养液Ⅱ：取少量RPMI-1640培养液，加入5-10ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素，混匀，加RPMI-1640补至100ml；

培养液Ⅲ：取少量RPMI-1640培养液，加入15-20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素、0.25g透明质酸，混匀，加RPMI-1640补至100ml；

处理液Ⅰ：取少量RPMI-1640培养液，加入10-15ml胎牛血清、10000U青霉素、5000U链霉素，混匀，加RPMI-1640补足至100ml；

处理液Ⅱ：取少量RPMI-1640培养液，加入15-20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素、1g透明质酸，混匀，加RPMI-1640补至100ml；

选择脱细胞真皮基质、胶原凝胶、胶原海绵或聚乳酸中的一种作为支架材料，所述支架材料以缓冲液清洗2-4次，于所述处理液Ⅱ中浸泡7-14天后，在0-4℃温度下保存，得到经处理的支架材料；

（2）原代培养：

（2-1）涎腺多形性腺瘤细胞原代培养：患者手术取下的涎腺多形性腺瘤肿瘤组织，于所述处理液Ⅰ中浸泡处理，取肿瘤组织块，清洗2-3次之后，于所述培养液Ⅰ中切成适于进行细胞培养的组织块，置于培养瓶底部，培养瓶于CO₂培养箱中倒置，使组织块贴附于培养瓶底部，2小时后将培养瓶放正，加入所述培养液Ⅰ，在CO₂培养箱中继续培养，24小时后更换所述培养液Ⅰ，此后每隔1天定期更换一次所述培养液Ⅰ，18-22天后，得到原代培养的肿瘤细胞；

（2-2）皮下纤维组织细胞原代培养：来自同一患者的正常皮下纤维组织，于所述处理液Ⅰ中浸泡处理，然后进行清洗，切成适于进行细胞培养的组织块，置于培养瓶底部，加入所述培养液Ⅱ后，于CO₂培养箱中培养，24小时后更换所述培养液Ⅱ，此后每隔3天定期更换一次培养液Ⅱ，15-19天后，得到原代培养的成纤维细胞；

（3）传代培养：