[发明专利]具有FRET效应的还原敏感型荧光纳米胶束及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因及药物载体领域，特别是涉及一种具有FRET效应的还原敏感型荧光纳米胶束及其制备方法。

背景技术

荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET）技术作为一种经典的荧光技术，与荧光成像技术结合，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面具有广泛的应用。FRET是指在两个不同的荧光基团中，当作为供体的荧光基团与作为受体的荧光基团的吸收光谱有一定重叠，并且这两个荧光基团的距离在1~10纳米时，荧光能量由供体分子向受体分子转移。使得供体分子的荧光强度比它单独存在时要低的多，而受体分子发射的荧光却大大增强。

近年来，具有环境响应性的智能型自组装形成的聚合物胶束作为药物载体在生物医学领域显示了良好的应用前景，引起了越来越多科学工作者的关注。智能型聚合物纳米胶束利用某些链段对环境的敏感性，在相应条件下使其发生降解、聚合物结构的相转变或体积相转变等，从而达到控制药物释放的目的。目前，已合成了多种基于一种或多种环境响应型的智能化的聚合物纳米胶束，如Jun Chen等合成了一种pH值和还原敏感双重响应的聚合物，用于细胞内的阿霉素运输，有效地增强了阿霉素在细胞内的释放。

但是，同时具有FRET效应和还原敏感响应的荧光纳米胶束一直未见报道。

发明内容

基于此，有必要提供一种同时具有FRET效应和还原敏感响应的荧光纳米胶束及其制备方法。

一种具有FRET效应的还原敏感型荧光纳米胶束的制备方法，包括：

制备聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）；

将mPEG-PCL溶于四氢呋喃（THF）中，加入三乙胺(TEA)并搅拌，再加入对硝基苯氯甲酸酯(4-nitrophenyl chlorformate,PNC)，室温搅拌反应过夜，经纯化处理得到mPEG-PCL-PNC；

将胱胺二盐酸盐(cystamine dihydrochlochloride)溶于二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)和吡啶的混合液中，室温搅拌4小时，将所述mPEG-PCL-PNC溶于二甲基亚砜，混合所述胱胺二盐酸盐和mPEG-PCL-PNC的溶液，并于35~50℃下连续搅拌反应2~3天，在重蒸水中透析3~4天，收集透析产物，冷冻真空干燥后得到mPEG-PCL-s-s-NH₂；

将所述mPEG-PCL-s-s-NH₂溶于二甲基甲酰胺中，加入异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)，所述mPEG-PCL-s-s-NH₂与FITC的摩尔比为1:1~1:5，常温下搅拌，反应过夜，在二甲基甲酰胺中透析1~2天，转移至重蒸水中继续透析2~3天，真空冷冻干燥得到mPEG-PCL-s-s-FITC；

将所述mPEG-PCL-s-s-NH₂溶于二甲基甲酰胺中，加入改性4-二甲胺偶氮苯-4′-羧酸(Dabcyl)，所述mPEG-PCL-s-s-NH₂与所述改性Dabcyl的摩尔比为1:1~1:5，常温下搅拌，反应过夜，在二甲基甲酰胺中透析1~2天，转移至重蒸水中继续透析2~3天，真空冷冻干燥得到mPEG-PCL-s-s-Dabcyl；

将所述mPEG-PCL-s-s-FITC和mPEG-PCL-s-s-Dabcyl分别溶于四氢呋喃中，然后按照所述mPEG-PCL-s-s-FITC与mPEG-PCL-s-s-Dabcy的质量比为1:1~1:3的比例混合得到混合溶液，在搅拌的过程中滴加重蒸水，将滴加了重蒸水的混合溶液转移到重蒸水中透析2~3天，得到具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束。

在其中一个实施例中，所述改性Dabcyl通过以下步骤制备：将Dabcyl溶于二甲基甲酰胺中，依次加入体积为所述二甲基甲酰胺的5~10倍量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，常温下搅拌反应过夜，离心取上清，得到改性Dabcyl。

在其中一个实施例中，所述制备mPEG-PCL包括步骤：

将用氢化钙干燥，减压蒸馏；取甲基化的聚乙二醇（mPEG），于80℃抽真空1小时；往所述甲基化的聚乙二醇中加入辛酸亚锡和干燥的在氮气保护下140℃反应8小时后，加入氯仿溶解反应产物，再用正己烷沉淀，抽滤，真空干燥后得到mPEG-PCL。

在其中一个实施例中，所述mPEG-PCL与所述三乙胺的摩尔比为300:1~100:1。