[发明专利]脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种以热休克（HSP）重组蛋白为抗原，建立动物多头蚴病免疫金标渗滤检测法。

背景技术

脑多头蚴病（Coenuriasis）又叫脑包虫病，是由带科的多头带绦虫（Taenia multiceps）的中绦期幼虫——脑多头蚴（Coenurus cerebralis）寄生于绵羊、山羊、黄牛、牦牛和骆驼等有蹄动物的脑和脊髓等处引起的一种寄生虫病，该病是我国草食动物的常见疾病，每年给畜牧业造成巨大的经济损失。

近年来，血清学诊断技术已应用于脑多头蚴病的诊断，但由于所用的诊断抗原主要是包囊囊液、多头蚴原头节和囊壁等虫体天然抗原，它们来源十分有限，不能满足实际的需要。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种以热休克（HSP）重组蛋白为抗原，建立动物多头蚴病免疫金标渗滤检测法，旨在解决血清学诊断技术已应用于脑多头蚴病的诊断，但由于所用的诊断抗原主要是包囊囊液、多头蚴原头节和囊壁等虫体天然抗原，它们来源十分有限，不能满足实际的需要的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法，该方法从羊脑多头蚴原头节提取总RNA，采用RT-PCR技术首次扩增出HSP基因序列，该基因的开放阅读框为408bp，编码136个氨基酸。将此基因克隆到pET-32a(+)载体，构建重组表达质粒pET-32a-HSP，经转化大肠杆菌BL21（DE3）后IPTG诱导表达，用SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物；以纯化后的表达蛋白作为抗原，建立检测羊脑多头蚴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法(DIGFA）

进一步，培养基和常用溶液的配制方法为：

利用超纯水配制溶液，用0.22μm的过滤器过滤配制好的IPTG溶液；

将超纯水800 mL 混合Yeast Extract5 g，Trypton、10 gNaCl10g，调节pH值至7.2，定容至1 000 mL，并于121℃高压蒸汽灭菌20 min，再置于4℃保存；

将琼脂粉加入液体LB培养基，于121℃的高压灭菌锅灭菌20min，最后将琼脂粉的浓度调节为1.5%(w/v)；最后在琼脂糖培养基温度降低后加入氨苄青霉素并倒板；

利用购买的氨苄青霉素和超纯水配制成工作液浓度100mg/mL，再用0.22μm滤器过滤除菌，于-20℃保存备用；

将27.5 g、硼酸54g Tris，置于20 mL 0.5 mol/L EDTA溶液，最后加超纯水定容至1 000 mL；

将1g琼脂糖粉末置于90mL超纯水，再加入10mL的5×TBE，定容至100mL；

0.8gN,N'一亚甲叉双丙烯酰胺、29.2g丙烯酰胺溶于适量超纯水中，定容至100mL，于4℃避光保存；

将18.17gTris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液pH为8.8，最后定容至100mL，并于4℃保存；

将12.11g Tris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液pH为6.8，最后定容至100mL，并于4℃保存；

将10gSDS干粉溶于80mL的灭菌超纯水中，同过加热溶解干粉，最后定容至100mL；

将1g过硫酸铵溶于水中，定容至10mL；

1.6 mL双蒸水、2 mL30%丙烯酸胺、1.5 mol/L Tris(pH8.8)1.3 mL、0%过硫酸铵0.05 mL、TEMED 0.002 mL、10%SDS 0.05 mL；

10%SDS0.01 mL、0.68 mL双蒸水、1.0 mo1/L Tris(pH6.8)0.13 mL、30%丙烯酞胺0.17 mL、10%过硫酸铵0.01 mL、TEMED 0.001 mL；

取14.4g甘氨酸、3gTris混合1gSDS溶解于超纯水，最后定容至1000mL；

缓冲液：将0.1%溴酚蓝、25%甘油、14.4mmol/L 2-巯基乙醇、2%SDS混合于60mmol/LTris-HCl；

将45mL甲醇，45mL水，10mL冰乙酸，0.25g考马斯亮蓝R-250；

90mL甲醇:水（1:1），10mL冰乙酸；

将Tris碱5.8g，甘氨酸2.9g，SDS（电泳级）0.37g，甲醇200mL，加去超纯水定容至1000mL；