[发明专利]一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法

说明书

技术领域

本发明属于纤维堆囊菌发酵技术领域，涉及一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法。

背景技术

埃博霉素B（Epothilone B，EPO-906）是由纤维堆囊菌产生的一种已进入临床抗肿瘤治疗研究的药物。目前埃博霉素的发酵产量很低，主要由两个原因。第一是埃博霉素对其生产菌株有毒性抑制作用，这在很大程度上限制了埃博霉素的发酵产量。虽然可以利用大孔吸附树脂XAD-16来解决这方面的困难，但树脂对发酵液中其他物质的非特异性吸附也为埃博霉素产量的提高带来新的困难。第二，纤维堆囊菌复杂的细胞行为。它们往往在固体培养基上能良好的生长、代谢并产生埃博霉素，但在液体培养基中生长时代谢行为往往会发生改变；如细胞成团生长，并且内外细胞的状态不一致；细胞存在自溶性现象；代谢状态不稳定等。因此开发一种能够作为埃博霉素生产菌株的固体化材料，并将其用于发酵液中将极大地增加埃博霉素的产量。

多孔陶瓷作为一种新型陶瓷材料，一直倍受生物、环保领域科研人员的青睐，这是因为它作为生物催化剂的载体具有气孔率高、化学稳定性好、比表面积大、体积密度小以及耐高温、耐腐蚀等特点，另外多孔陶瓷还具备无毒害作用、稳定性优异、传质性能好、机械强度高、生物亲合性好、操作简单、价廉易得等优点。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，为纤维堆囊菌生产埃博霉素B提供生长代谢的固体附着面，从而提高发酵产量，降低抗肿瘤药物埃博霉素的生产成本。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，包括以下步骤：

1）将纤维堆囊菌接种于M26固体培养基上培养，然后将培养得到的菌体接种于M26液体培养基中，振荡培养；

2）将经M26液体培养基培养后的液体，高速搅拌使菌体均匀打散后，离心收集沉淀，加入无菌水重悬得纤维堆囊菌到菌悬液；

3）按100mL发酵液接种5～10mg菌种的比例，将纤维堆囊菌菌悬液接种于发酵液中，然后加入菌种质量50～400倍经发酵液浸泡处理过的硅藻土基多孔陶瓷材料块，在25～35℃，180～220rpm摇床培养72～96h。

所述在温度28～30℃，转速180～200r/min下摇床培养72～96h。

所述的纤维堆囊菌为纤维堆囊菌ATCC25532。

所述在M26固体培养基上培养时其培养条件为：30℃下，恒温培养箱中培养72～96h；

所述在M26液体培养基上培养时其培养条件为：30℃，200rpm摇床振荡培养72～96h。

步骤2）所述的高速搅拌时间为10～20min。

步骤2）和步骤3）所述的离心过程是在4℃下，8000rpm，离心10min。

所述的多孔陶瓷的孔径在5～10μm，比表面积为40～50m²/g，能够吸附固定粘细菌。

所述的多孔陶瓷抗折强度为15～20MPa，吸水率达到50%。

所述的多孔陶瓷的处理为：

多孔陶瓷块经150℃高温灭菌10～30min，自然冷却后，加入发酵液完全覆盖多孔陶瓷块并高出10～50mm，常温下摇晃0.5～1h，静置1～2h后倾去发酵液，100～105℃干燥后待用。

所述的多孔陶瓷块在发酵时悬浮在发酵液中。

所述的100mL发酵液中多孔陶瓷块的加入量为1～2g。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明的基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，在埃博霉素B发酵生产时，通过添加硅藻土基多孔陶瓷对生产菌株纤维堆囊菌提供附着物，帮助其在培养液中固定，这样可以为在液体环境中生长的粘细菌细胞提供一个固体附着面，从一定程度上满足粘细菌生长代谢产生埃博霉素的固体培养微环境，克服游离发酵培养时成团成片生长所带来的传质不均匀、代谢不稳定等难题。

进一步，本发明的基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，埃博霉素生产菌株被硅藻土基多孔陶瓷固定，也有利于缓解埃博霉素对其生产菌株的反馈抑制作用，从而提高发酵产量，降低抗肿瘤药物埃博霉素的生产成本，