[发明专利]一种靶向STAT3的慢病毒干扰载体的构建及鉴定

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其一种靶向STAT3的慢病毒干扰载体的构建及鉴定构建及鉴定。 

背景技术

信号转导是细胞生命活动的一种最基本和最重要的方式，细胞因子受体介导的JAK-STAT (janus kinase/signal transducer and activator of transcription)信号传导途径是目前心血管分子生物学研究领域的热点，它把细胞膜上感受的信号直接传递到核内--启动基因转录，环节少而简洁；近来研究表明，JAK-STAT途径是人体内生理和病理反应的共同通路之一，与多种疾病发病及防治密切相关，广泛参与细胞应激、生长、增殖、分化和凋亡等多种生物学效应，是多种细胞因子和生长因子信号转导的重要途径。国内目前有文献对正常及低氧等损害情况下血管平滑肌细胞(VSMC)及微血管内皮细胞中全部JAK和STAT的基因和蛋白表达和变化情况进行了初步的研究。显然深入研究JAK-STAT及其它信号转导系统对探讨疾病发病机制和防治具有重要意义。 

近年来，RNA干扰(RNA interference，RNAi)这一新兴的生物工程技术在疾病的发生、发展及治疗研究领域发挥越来越重要的作用，为人们针对某种基因突变或过表达所引起的疾病治疗提供了新的策略。本研究通过构建靶向TLR2的shRNA干扰载体PLKO.1-TLR2-shRNA，并筛选出最佳抑制效率的干扰载体，为进一步研究JAK-STAT信号通路参与调控血管再狭窄过程中细胞增殖迁移的分子机制及为血管桥再狭窄的分子靶向治疗奠定了基础。 

发明内容

本发明提供一种靶向STAT3的慢病毒干扰载体的构建及鉴定构建及鉴定方法。 

靶向STAT3的慢病毒干扰载体的构建及鉴定构建及鉴定，其步骤为： 

1)根据Gene Bank中STAT3的cDNA序列，参考shRNA设计原则，选择cDNA序列上的四个部位作为目标序列，同时将选中的shRNA中的碱基序列随机打乱设计为阴性对照，对照序列经BLAST检测证实与STAT3mRNA及其他基因编码序列无同源性。 

2)shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5′端添加了CCGG，与AgeI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5′端添加了AATTCAAAAA，与EcoR I酶切后形成的粘端互补。以下序列由上海生工生物技术有限公司合成。 

3)靶向STAT3的shRNA干扰载体PLKO.1-STAT3-shRNA构建及鉴定，用限制性内切酶AgeI、EcoRI酶切PLKO.1，连接退火片断和载体，转化，涂板，挑克隆，小抽质粒，并将克隆送上海英骏生物技术有限公司测序鉴定； 

4)将干扰效果最好的PLKO.1-stat3(a1)，进行慢病毒包装，-70℃冰柜保存。 

本发明的优点： 

1)STAT3是近年来研究异常活跃的转录因子，在细胞因子和生长因子的作用下，通过JAK或丝氨酸激酶诱导，STAT3激活并形成p-STAT3，两个分子p-STAT3相互作用形成二聚体进入细胞核，与目的基因的启动子区域结合，调节靶基因转录。研究表明在多种肿瘤组织和细胞中存在STAT3的异常活化和过表达，并上调与细胞增殖、迁移、细胞凋亡和血管生成等相关基因的表达，在细胞增殖性疾病中起重要作用，STAT3信号通路已成为调控细胞增殖、凋亡新的 研究热点。 

2)为进一步研究JAK-STAT3信号通路对血管平滑肌细胞增殖的作用，本研究构建了靶向STAT3的shRNA重组慢病毒表达载体，特异性阻断JAK-STAT3信号通路中的关键分子STAT3蛋白的表达。针对目的基因我们设计三对shRNA序列，构建了三个重组慢病毒表达载体，并将这些重组载体包装病毒后感染大鼠血管平滑肌细胞，采用Western blot法验证重组慢病毒对靶基因的抑制效率。 

3)我们选择抑制效率高的shRNA-3进行后续研究，为进一步研究JAK-STAT3信号通路在血管平滑肌细胞增殖、凋亡等作用奠定了基础，为抑制血管平滑肌细胞增殖的基因治疗提供了新的思路。 

具体实施方式

下面结合具体实施实例，对本发明进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。