[发明专利]一种环氧化物水解酶基因(EH-B)原核表达及手性环氧氯丙烷的制备

权利要求书

1.一种来源于Aspergillus usamii E001的新型B类环氧化物水解酶，其cDNA序列和氨基酸序列分别为SEQ IDNO：1和SEQ IDNO：2。

2.A.usamii E001新型环氧化物水解酶B基因序列克隆及表达的方法：

(1)从已克隆的A.usamii E001基因cDNA序列，然后对该序列进行开放读码框分析和信号肽预测，根据预测的结果设计一对特异性引物，引物序列如下：

AuEHB-F：5′-GAATTCATGGCACTCGCTTACAGCAA-3′，含EcoR I酶切位点；

AuEHB-R：5′-GCGGCCGCTCATTTTCTACCAGCCCATAC-3′，含Not I酶切位点；

提取A.usamii E001的总RNA，按照TaKaRa生产的RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中的说明书进行RT-PCR：以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和AuEHB-F为引物进行第一轮PCR(94℃，2min；94℃，30s，51℃，30s，72℃，80s，30个循环；72℃，10min)；以第一轮的PCR产物为模板、AuEHB-F和AuEHB-R为引物进行第二轮PCR(94℃，2min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，70s，30个循环；72℃，10min)；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA LadderMarker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AusEH-B，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得到Aus EH-B成熟肽cDNA序列；

(2)将测序结果正确的pUCm-T-AusEH-B与pEH-28-a-c(+)质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pEH-28-a-AusEH-B，并对重组质粒进行序列测定；

(3)E.coli Rosetta(DE3)/EH-B的构建、表达、产物纯化及活性测定：将pEH-28-a-AusEH-B转化E.coli Rosetta(DE3)，在含有氯霉素及Kna抗性平板上筛选转化子；重组质粒EcoR I和Not I酶切验证；挑去阳性转化子于2mL含Kna/氯霉素抗性的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，以1％的接种量转接到30mL相同培养基中，37℃振荡培养至对数生长中期(OD600为0.6～0.8)，加人IPTG至终浓度为0.5mmol/L，诱导过夜；同时以未诱导工程菌及含空质粒的菌株为阴性对照；诱导结束后，收集菌体并冷冻干燥，测定手性气相色谱环氧化物水解酶活性。