[发明专利]一种米曲霉阿魏酸酯酶基因(faeA)的克隆及表达

说明书

技术领域

本发明涉及来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的一种新型A型阿魏酸酯酶(faeA)基因成熟肽cDNA序列的克隆及表达，属于生物工程技术领域。

背景技术

阿魏酸(ferulic acid)是肉桂酸的一种，化学名是(3-甲基-4-羟基)-3-苯基-2-丙烯酸，或者3-甲基-4-羟基肉桂酸，是植物界普遍存在的一种酚酸，其在植物细胞壁结构中起着重要的作用，可以在植物细胞壁的木质素与木质素之间、木质素与半纤维素之间、半纤维素与半纤维素之间形成交接，从而构成一个骨架结构，使得整个细胞壁变得坚硬。在谷物的细胞壁中，阿魏酸的单体和多种二聚体主要以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上。阿魏酸主要的生理功能有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂及防治冠心病，并具有抗菌消炎以及抗突变和防癌作用。反式阿魏酸在美国、日本已允许用作食品添加剂，目前在医药、食品和化妆品工业中广泛应用。

阿魏酸酯酶(EC.3.1.1.73)又称肉桂酸酯酶、肉桂酰酯酶，是羧酸水解酶的一个亚类，也是一种胞外水解酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚阿魏酸酯和多聚阿魏酸酯中的酯键，一方面促进半纤维素、木素与纤维素的分离，有利于纤维素的进一步利用；另一方面促进阿魏酸等酚酸类物质的分离。阿魏酸酯酶在生物乙醇生产、制浆造纸、动物饲料生产和生物合成中具有广泛的应用价值。目前对于阿魏酸酯酶的研究，主要集中于对原始菌株培养条件的优化以增加产酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者采用基因工程技术和蛋白质工程技术来提高阿魏酸酯酶的酶活。

近年来，随着对自然界半纤维素资源的开发利用，尤其是反式阿魏酸优越的生理功能，人们对不同来源和不同特性的阿魏酸酯酶进行了深入地研究，阿魏酸酯酶的应用领域得到了不断地拓展，除了在食品方面的利用，其在造纸、饲料、纺织、酿酒、医药、环境和能源等工业领域逐步开始了广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种源于Aspergillus oryzae CICC 40186的新型A类阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表达的方法，为该阿魏酸酯酶的产业化生产奠定理论基础。根据氨基酸序列以及底物特异性等，将阿魏酸酯酶分为A、B、C、D四类，Shin等研究表明这四类阿魏酸酯酶都含有不同的保守序列和基序。根据同源比对，Aspergillus oryzae CICC 40186分泌的为A型阿魏酸酯酶，命名为Aor FaeA，其相应的基因命名为Aor faeA。

A.oryzae菌株购于中国工业微生物菌种保藏中心(China Center of Industrial CultureCollection，CICC)，编号为40186。

本发明的技术方案：一种源自A.oryzae CICC 40186的新型的A类阿魏酸酯酶(Aor FaeA)，其基因(Aor faeA)成熟肽cDNA核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

所述的由成熟肽cDNA序列所推导的Aor FaeA氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

所述的重组阿魏酸酯酶的活性测定方法：

以对硝基苯酚阿魏酸酯(pNPF)作为反应底物，反应体系为200μL，缓冲体系为25mmol/LpH6.4的磷酸缓冲液(含2.5％Tritonx-100)，对硝基苯酚阿魏酸酯(溶于DMSO)终浓度为0.6mmol/L，加入100μL的酶，测定产物对硝基苯酚在410nm处吸光度。同时设置空白对照(100μL粗酶液于沸水浴中灭酶3min，其他操作步骤同上)。

醋酶活力定义：在上述反应条件下，每分钟催化底物水解生成1μmoL对硝基苯酚所需要的酶量为一个活力单位(U)。

所述的Aor faeA成熟肽cDNA序列的克隆和表达的方法如下：

(1)从已报道的Aspergillus oryzae RIB 40基因组信息中找出编码米曲霉A类阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后对该序列进行开放读码框分析和信号肽预测，根据预测的结果设计一对特异性引物，引物序列如下：

FAE-F：5’GAATTCGCAATCACTCAGGGGATCT 3’

FAE-R：5’GCGGCCGCCTACCATGTACAGGCTCCG 3’