[发明专利]pUC19-TVG质粒的构建及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种能够有效解决基于酶切位点基因融合问题的新载体及其应用示范。

背景技术

pBR322质粒是目前在基因克隆中广泛使用的一种大肠杆菌质粒载体。符号质粒载体pBR322中的“p”代表质粒；“BR”代表两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首；“322”是实验编号。pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。在pBR322质粒载体的构建过程中，一个重要目标是缩小基因组的体积，移去一些对基因克隆载体无关紧要的DNA片段，限制酶识别位点，同时还要设法使质粒同存在任何易位子统统失去功能。易位子的转移(即易位)有可能导致选择记号的丧失，甚至也有可能使克隆的DNA片段丧失或重排。pBR322质粒是由来源于pBR322质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因(amp^r)，来源于pSC101质粒的四环素抗性基因(tet^r)和来源于ColE1的派生质粒Pmb1的DNA复制起点(ori)三部分组成。质粒载体pBR322的大小为4361bp，相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。

pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5′-端带有一段多克隆位点的lacZ′基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。一种典型的pUC系列的质粒载体，包括来自pBR322质粒的复制起点(ori)、氨苄青霉素抗性基因(amp^r)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点、大肠杆菌β-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ′基因和位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点(MCS)区段，但它并不破坏该基因的功能。pUC质粒载体的优点是：(1)具有更小的分子量和更高的拷贝数，如pUC8为2750bP，pUC18为2686bP。(2)适用于组织化学方法检测重组体pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的：lacZ′基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。(3)具有多克隆位点MCS区段pUC8质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点MCS区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。pUC19载体是pUC载体系列中极具代表性一种质粒，适合于DNA片段的克隆、进行DNA测序、对外源基因进行表达等。虽然pUC19载体已被国内外研究工作者广泛使用，但鉴于其功能单一，目前已逐步被其他载体所取代。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够有效解决基于酶切位点基因融合问题的方法，该方法基于一种新型的载体pUC19-TVG。同时该载体还能够解决长片段基因克隆过程中极易出现的错配问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种新型的载体pUC19-TVG，所述载体能够便于实现多基因片段依赖酶切位点的融合及单一基因的分段和拼接，其特征在于，所述载体是基于限制性内切酶酶切及连接原理由载体pUC19改造而来，载体中不含Xho I、Mlu I、Sac I、Kpn I、Cla I、EcoRV、Nco I、Pst I、BglII、SalI、Pst I、BamH I、Sca I、XbaI酶切位点，所述pUC19-TVG多克隆位点处序列为(SEQ ID NO：1)，其结构如图1所示。

本发明公开了pUC19-TVG的构建方法，具体包括以下步骤：

1)引物设计及基因扩增

a.根据pUC19中多克隆位点区域序列设计反向引物TvectorG，

TvectorG：5′-AAGCTTGCGGCCGCACGCGTTATTCGCAGCATCCTCCG-3′(SEQ ID NO：2)；

其中TvectorG的5′端包含酶切位点Hind III、Not I、Mlu I(下划线所示)，为构建质粒及基因拼接提供连接端。