[发明专利]一种共表达faeA和xyn11A的酵母系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种共表达源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的阿魏酸酯酶A成熟肽基因(faeA)和β-1，4-木聚糖酶基因(xyn11A)的毕赤酵母新表达系统，属于生物工程技术领域。

背景技术

半纤维素是自然界的第二大类多糖聚合物，作为木质素和纤维素中间的连接物，广泛存在于植物细胞壁。半纤维素的降解产物具有广泛的应用价值，因此，如何充分利用丰富的半纤维素资源成为研究的热点。已有报道表明，阿魏酸酯酶可以和其它的半纤维素酶(如木聚糖酶)协同作用使微生物对植物细胞壁中半纤维素进行最大程度的降解。阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，ferulic acid esterase，FAE)又称肉桂酸酯酶，是羧酸水解酶的一个亚类，属于胞外酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来。自1991年Faulds等首次分离出阿魏酸酯酶以来，已有超过30种阿魏酸酯酶被纯化，其主要生物功能是水解植物细胞壁中多糖与阿魏酸连结的酯键，释放出游离的单体阿魏酸或阿魏酸二聚体。β-1，4-内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8，endo-β-1，4-xylanase)是一类能够专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称，主要从主链内部作用于木糖苷键，是木聚糖降解过程中最重要的酶之一。能够产生木聚糖酶的微生物有很多，包括丝状真菌、细菌、放线菌等。两种酶均广泛应用于食品、医药、饲料、造纸和印染等领域。

在食品工业中可利用阿魏酸酯酶打断阿魏酸与细胞壁材料如麸皮、秸秆中多糖的交联，高效降解多糖并获得反式阿魏酸，它和阿拉伯木聚糖酶联合作用的水解产物低聚糖(主要是低聚木糖)、阿魏酸都是重要的功能性食品基料，戊糖可用于酒精发酵、生产木糖醇等。在饲料工业中，利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料，可以将阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来，从而破坏细胞壁的骨架结构，使得木质素、半纤维素及纤维素之间的连接被部分打破，结构变得比处理前疏松，变得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用，可以提高饲料的利用效率。

早期对于阿魏酸酯酶和β-1，4-内切木聚糖酶的研究多集中在产酶菌株的选育、发酵条件的优化、酶的分离纯化、酶的理化性质、酶的复合诱变、酶的水解机理等方面。随着分子生物学研究的不断深入与完善，越来越多的工作集中于酶的基因克隆和高效表达方面，如：构建和筛选优良的高效基因工程菌株；基于酶结构与功能的关系，通过定点诱变改变酶活性位点，从而实现催化功能的改变，以拓宽其应用范围等。不同来源的两种酶基因已经被克隆，并在大肠杆菌、酿酒酵母、毕氏酵母等表达系统中进行了表达。然而在毕赤酵母系统中进行共表达的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是构建一种新型的共表达阿魏酸酯酶A和β-1，4-木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌。

本发明的技术方案：

所设计到的pPICZαA-faeA和pPIC9k-xyn11A均为本实验室构建和保藏。

所述的重组FaeA和重组Xyn11A活性的测定方法：

以阿魏酸甲酯(MFA)为底物，高效液相(HPLC)分析阿魏酸的释放量。具体操作按为：移取900μL MFA(1mM，pH 6.0)于2mL EP管中，45℃保温10min，加入100μL适当稀释的酶液，反应10min后加入400μL冰乙酸终止反应，立即混匀进行高效液相分析。以先在酶溶液中加入400μL冰乙酸，再加底物溶液为对照。色谱条件：以甲醇、1％乙酸一步梯度洗脱，在10min内，甲醇浓度由50％上升至80％，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长320nm，上样量20μL。根据峰面积，从标准曲线查出相应的阿魏酸量，从而计算酶活。酶活单位定义：在测定条件下(45℃、pH 6.0)每分钟产生1μmol阿魏酸所需的酶量为一个酶活单位(U)。