[发明专利]一种水稻MYB转录因子蛋白基因OsMyb1及其应用

权利要求书

1.水稻MYB转录因子蛋白基因OsMyb1，其特征在于该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMyb1编码的水稻MYB转录因子蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMyb1的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是将所述的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMyb1插入双元表达载体pCAMBIA1300S的KpnⅠ酶切位点所得。

5.水稻MYB转录因子蛋白基因OsMyb1的基因工程应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMyb1在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于包括如下步骤：

1）总RNA的提取

选用水稻抗稻瘟病品种“黑壳子粳”，待水稻幼苗长至3-4叶期，用稻瘟病菌孢子5×10⁴ml^-1接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于-80℃冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量；

2）水稻MYB转录因子蛋白基因OsMyb1的克隆

以拟南芥基因OsMyb1序列为探针，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到858bp水稻Myb转录因子蛋白基因OsMyb1的全长序列，并设计两端引物：P1:SEQ ID NO.3，P2:SEQ ID NO.4，将步骤1）获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45s，56℃复性1min，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸5min，最后Tag酶72℃保温10min末端加A后克隆至pGEM-T载体，测序获得水稻Myb转录因子蛋白基因OsMyb1的cDNA序列SEQ ID NO.1；

3）植物表达载体的构建

根据水稻Myb转录因子蛋白基因OsMyb1的cDNA序列SEQ ID NO.1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上都引入限制性内切酶位点KpnⅠ，P3和P4引物序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；

以步骤2）中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsMyb1的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，利用引入的限制性内切酶位点KpnⅠ进一步将OsMyb1克隆到双元表达载体pCAMBIA1300S，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确；

4）转基因植株的获得

将步骤3）获得的表达载体pCAMBIA1300S转入农杆菌，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，转基因植株经PCR,Southern杂交以及RT-PCR验证为阳性。将生长至3-4叶期的转基因T₂代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。