[发明专利]凹凸棒土负载壳聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法

说明书

技术领域

    本发明属于微生物活性保护研究领域，具体地，涉及一种凹凸棒土负载壳聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法。

背景技术

微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。橙色粘球菌是土壤中分离得到的粘细菌之一，多用于原核生物社会学行为研究的模式菌，其保存方法主要有传代培养保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、冷冻保藏法、冷冻干燥保藏法等，各种保藏方法都有其缺点，如耗时、耗材、设备费用昂贵等。

固定化微生物技术是在固定化酶技术的基础上发展起来的一项新的生物技术，采用物理或化学方法将微生物限定在一定的空间内，从而保持微生物活性。通常采用的固定化微生物技术主要有吸附法、载体结合法、交联法和包埋法等。

有多篇文献及专利报道采用固定化保藏菌种，例如文献“光合细菌G3菌株固定化保存方法的研究，安徽农业科学，2011,39（2）：676-678”，申请号为200710018010.8的专利“基于固定化细胞技术的菌种保藏方法” 等都报道了采用固定化细胞技术进行菌种保藏的方法。尚未检索到凹凸棒土负载壳聚糖对橙色粘球菌细胞固定化的报道。

载体材料的性能对固定化微生物功能的发挥起着至关重要的作用。通常载体的表面粗糙度与电荷是影响固定化速率的重要因素，载体材料的表面越粗糙，越有利于微生物在其表面附着固定，同时孔洞和缝隙等的存在对已吸附的微生物具有保护的作用，使它们免受水力剪切的影响。

凹凸棒土是一种多孔型链层状含水富镁铝硅酸盐类粘土矿物，晶体结构内部沸石通道的存在赋予了凹凸棒土巨大的内表面积，表面丰富的Si-OH 基团对有机质具有很强的亲和力，可直接或通过适当的改性处理用于固载催化剂，改性凹凸棒土作为生物催化剂酶的载体，在固定化酶的技术中被广泛使用。

发明内容

本发明的目的是：提供一种凹凸棒土负载壳聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法，利用凹凸棒土负载壳聚糖固定橙色粘球菌，降低橙色粘球菌活菌制剂生产成本，提高活菌存活率，操作方便，可适用于粗放的工业化大生产。

本发明的技术解决方案是：以凹凸棒土为原料，对凹凸棒土进行改性处理后负载壳聚糖，再采用包埋、吸附法相结合对橙色粘球菌进行固定化。

其中，凹凸棒土负载壳聚糖包被橙色粘球菌固定化方法包括以下步骤：

（1）凹土纯化：凹土与去离子水混合，凹土与去离子的比例为1:5（w/v），常温下100r/min搅拌24h，静置沉降24h后倒掉最下层杂质和上清液，加入与上清液等量的去离子水，再常温100r/min搅拌24h，静置24h倒掉上清液和下层杂质，抽滤，105℃烘干，得纯化凹土；

（2）凹土改性：取纯化凹土，加入体积浓度为60%的硫酸溶液，凹土与60%的硫酸溶液的比例为1:5（w/v），常温下以100r/min的转速搅拌24h，抽滤，水洗滤饼至水为中性，滤饼105℃烘干，得改性凹土；

（3）凹凸棒土负载壳聚糖：用3%(v/v)的醋酸水溶液缓慢溶解脱乙酰度为90%的壳聚糖，配置浓度为5%（w/v）的壳聚糖溶液；取改性凹土加入浓度为5%（w/v）的壳聚糖溶液中，改性凹土与壳聚糖的质量比为1:0.3，50℃搅拌6 h，静置6 h后除去上清液，抽滤，滤饼115℃干燥，冷却，研细，过160目筛，得凹凸棒土负载壳聚糖的固体吸附剂；

（4）菌株活化：取一株橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04，保藏号为CGMCC No. 2893，菌株在CY培养基上34℃培养1天，在发酵培养基中34℃、150rpm摇瓶培养2天，接种量为10⁶CFU/ml；该菌株16S rDNA的GenBank登录号为FJ826620；所述的CY培养基组成为：每1000ml水中含有酪素水解蛋白胨3g，酵母膏1g，牛血白蛋白0.5g，泛酸钙0.5g，pH7.5； 所述的发酵培养基组成为：每1000mL水中含有可溶性淀粉8g ，黄豆粉12g，蔗糖10g，葡萄糖2.5g，酵母膏0.25g , CaCl₂ 1g， MgSO_4·7H₂O 0.5g， pH 7.5；