[发明专利]多形汉逊酵母突变菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的应用

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种低能离子诱变多形汉逊酵母突变菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的应用。

背景技术

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是一种广泛存在于生物体内的活性三肽，含有γ-谷氨酰基和巯基，可参与多种生物学反应，对于维持生物体内适宜的氧化还原环境具有重要作用。由于GSH具有解毒，抗氧化和防衰老等重要生理功能，在临床，医药，食品加工以及化妆品等领域具有广阔的应用前景。

多年来，国外对GSH的生物合成研究较多，并将基因工程菌株应用于GSH的生产，目前其GSH的产量基本垄断中国市场。与国外相比，国内对GSH生物合成研究甚少、起步也较晚，并且用于生产GSH菌种的发酵水平低，生产设备及产品的后续提取工艺落后，产品收率低，这是目前高效发酵生产GSH的主要瓶颈之一，也是影响企业经济效益的最根本因素。为解决上述问题，首先迫切需要选育出发酵生产GSH水平高的突变菌株

目前，发酵GSH所用菌种最为常见的是酵母菌，其中酿酒酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属和裂殖酵母属胞内谷胱甘肽含量较高。多形汉逊酵母（H.polymorphaDL-1）是一种耐热酵母，最高生长温度达49℃，其具有如下优点如生长、分裂速度较快，生存力强，易于高密度发酵培养，能在廉价的合成或半合成培养基上高密度生长。这不仅可以缩短发酵时间，降低对发酵设备的制冷要求，而且可以减少大规模培养时污染的风险。但野生型多形汉逊酵母细胞中GSH的含量并不高。

20世纪90年代，低能离子注入技术逐渐应用于工业微生物选育，与常规诱变育种方法如紫外线、X射线、γ射线以及亚硝基胍等方法相比，低能离子注入技术表现出对靶物质损伤小，技术操作简单，突变频率高，突变谱广等优点。目前，利用离子注入进行微生物菌种改良已在生产实践中得到广泛的应用，并取得了显著的经济效益和社会效益。同时，以微生物为实验对象进一步对离子注入的诱变机理进行研究，不仅可以指导微生物菌种改良，也可以深入地解析注入离子与生物体的作用机制，为离子注入的广泛应用提供理论基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多形汉逊酵母突变菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的应用，该突变菌株具有耐高温、生存能力强，易培养等优点，是一种GSH高产菌株。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种多形汉逊酵母突变菌株，该菌株的命名为HansenulapolymorphaDL-18，所述菌株保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC No.6642。

所述突变菌株的诱变方法为低能离子辐照方法。

所述低能离子辐照的出发菌株为多形汉逊酵母ATCC No.26012。

所述低能离子辐照采用低能N+作为诱变源，最佳注入剂量为1.5×10¹⁶~2.5×10¹⁶ions/cm²，最佳注入能量为15~25KeV。

所述突变菌株的抗性筛选培养基为添加Zn²⁺的YPD培养基，Zn²⁺的添加浓度为800~1500mg/L。

上述多形汉逊酵母突变菌株在谷胱甘肽生物合成中的应用。

所述生物合成为发酵培养，发酵培养过程中首先于40～49℃培养10～16h，然后将培养温度降低为30～40℃继续培养36～40h。

本发明诱变GSH高产菌株的方法，主要依据低能离子注入诱导受体细胞突变原理，对H.polymorphaDL-1进行诱变。首先，将保存的菌株在37℃活化8-10h后，经种子培养，取一定量处于对数生长期的种子，通过血球计数板计数确定稀释倍数，使菌体浓度为1.0×10⁷CFU/ml。其次，制作菌膜，无菌风吹干后用离子束生物工程改性设备进行离子注入，接着在恒温培养箱中37℃温浴两小时后，接种于YPD培养基，37℃培养72h。通过实验设计确定最佳的离子注入剂量及能量。最后，通过Zn²⁺抗性筛选GSH高产菌株，并进行传代培养检测其遗传稳定性，收获细胞后测定胞内、发酵液中GSH含量及发酵液中残留糖量。

本发明筛选获得了一种高产GSH菌株，命名为HansenulapolymorphaDL-18，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所），保藏日期为2012年9月29日；保藏编号为CGMCC No.6642；分类命名为Hansenulapolymorpha。