[发明专利]一种基因载体材料及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因治疗技术领域，尤其涉及一种基因载体材料及其制备方法和应用。

背景技术

基因治疗是将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的的生物医学技术。纠正的途径可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。

自1990年第一例基因治疗的尝试后，基因疗法在肿瘤、免疫缺陷疾病、AIDS等难以攻克的疾病中多有研究及应用。基因疗法多依靠固定的基因转染体系将所需要的目的基因转染至目标细胞中以表达所需产物。基因转染体系主要有病毒载体转染体系和非病毒载体转染体系，客观来讲，两种体系都有自身的优缺点。

病毒载体转染体系以其转染的高效性在当前的研究中有着广泛的应用。但是随着研究的深入，在临床应用及研究中，病毒载体的安全性越来越遭受怀疑，病毒载体在应用中出现的免疫源性、组织富集性等问题以及在临床试验中出现的严重副反应使研究者的目光开始转向另一种转染体系——非病毒载体转染体系。

非病毒转染体系以其存在较低的毒性和免疫原性、较容易合成获取而为研究者所青睐，但是低下的转染效率是非病毒载体无法逾越的瓶颈，使得非病毒载体在基因治疗中的应用受到了极大的限制。

因此，基因治疗中，载体的安全性和合成载体的低运转效率等问题是目前的主要局限。

肝脏疾病是临床常见病、多发病，严重危害人体健康。肝脏主要由肝实质细胞（PC）、窦状上皮细胞（SEC）、枯否细胞（KC）、肝星状细胞（HSC）组成，其中占肝细胞约20%的SEC细胞和占肝细胞约15%的KC细胞表面都大量表达甘露糖受体。

甘露糖受体是一类广泛存在于抗原呈递细胞表面的受体，其功能表现在抗原呈递细胞（APC）的抗原呈递和T细胞传递上。甘露糖受体属于C型凝集素家族，是一类钙依赖型的受体，该受体含多糖识别的结构域（Carbohyrate Recognition Domain，CRD），主要有存在于巨噬细胞表面的巨噬细胞甘露糖受体CD206，存在于Langerhans细胞上的Langerin(CD207)，存在于树突状细胞上的DC-SIGN（Dendritic cell specificICAM-3 grabbing non-integrin），以及存在于肝窦内表皮细胞上的甘露糖受体。针对树突状细胞上的特异性受体DC-SIGN，研究表明甘露糖对其有特异性结合，且其结合程度随着寡糖链的增加而增加。

针对肝脏疾病的治疗方案是需基于高治疗指数和肝脏靶向的给药系统，为了实现肝脏靶向的给药要求，构建能传递至肝细胞内的基因传递系统为当务之急。

发明内容

本发明提供了一种基因载体材料，该基因载体材料能被细胞表面的甘露糖受体特异性识别，具有良好的肝脏靶向性；且毒性低，基因转染效率高。

一种基因载体材料，它为多聚糖6-羟基位接枝多胺形成的聚合物。

若无特殊说明，本发明所述多聚糖6-羟基位是指多聚糖分子中各个单糖的6-羟基位。

为能被细胞表面的甘露糖受体特异性识别，所述多聚糖优选为壳聚糖、葡甘露聚糖或甘露聚糖。多聚糖的分子量优选为10~200kDa，该分子量范围之外的多聚糖长度不适宜，会降低基因载体材料的转染效率。

多胺分子具有带正电荷的氨基，有利于与具有带负电荷的磷酸基的DNA或RNA结合，从而增强所述基因载体材料携带基因的能力，提高基因转染效率。

本发明所述多胺优选为精胺、亚精胺或腐胺，这些化合物在生物体中发挥重要功能，毒性较低。所述多胺的接枝率优选为6~27%。

本发明还提供了所述基因载体材料的制备方法，包括：

（1）将多聚糖用酰化试剂酰化，制备酰化中间体；

（2）将所述酰化中间体与多胺反应，获得所述基因载体材料。

由于多胺难以直接与羟基反应而接枝到多聚糖上，因此，本发明利用酰化试剂对多聚糖6-羟基位进行酰化，再通过酰化的羟基与多胺反应，制备所述基因载体材料。所述酰化试剂优选为羰基二咪唑、二环已基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺。

优选地，步骤（1）和（2）中的反应均在有机溶剂中进行，所述有机溶剂优选为三氯甲烷、四氢呋喃或二甲基亚砜。有机溶剂能将反应原料、反应中间体、反应产物充分溶解并形成均一稳定溶液，提供良好的反应环境，促使反应进行完全。