[发明专利]利用卵黄脂磷蛋白抗体定性检测鱼类卵黄原蛋白的试剂盒

权利要求书

1.一种利用卵黄脂磷蛋白抗体定性检测鱼类卵黄原蛋白的试剂盒，包括一个盒体，该盒体内装有：1)PVDF膜2张；2)阴性对照血浆1支；3)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗1支；4)封闭液、洗涤液、显色液各1支，所述的洗涤液为TBST；封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST；显色液为含0.06%(m/V)3’-二氨基联苯胺(DAB)的10mM Tris-HCl；其特征在于它还装有5)金鱼卵黄脂磷蛋白纯品1支；6)鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体1支。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的金鱼卵黄脂磷蛋白纯品为100μg/ml的金鱼卵黄脂磷蛋白溶液。

3.如权利要求1所述的利用卵黄脂磷蛋白抗体定性检测鱼类卵黄原蛋白的试剂盒，其特征在于所述的金鱼卵黄脂磷蛋白纯品的制备方法如下：

取卵黄形成后期的雌性金鱼卵巢组织，去除结缔组织，收集鱼卵，加入3倍体积4℃预冷的匀浆缓冲液混合，在冰浴条件下用玻璃匀浆器匀浆，4℃，10000g离心20分钟，收集上清液；向上清液中缓缓加入(NH₄)₂SO₄粉末至70%的饱和度，盐析过液；10小时后，在4℃下，以8000g离心10分钟，弃去上清，将沉淀重新溶解于25mM Tris-HCl(内含0.07M NaCl，pH7.5)，获得卵匀浆提取液；

取1ml卵匀浆提取液加入Sephacryl S-300层析柱，用含0.07M NaCl的25mM Tris-HCl(pH7.5)洗脱，收集含有金鱼卵黄脂磷蛋白的样品用于离子交换层析(DEAE-Sepharose Fast Flow)，用分别含0.07M、0.1M、0.2M、0.3M和1.0M NaCl的Tris-HCl缓冲液(25mM，pH7.5)进行不连续洗脱，收集0.2M脱组分，签定为金鱼卵黄脂磷蛋白纯品。

4.如权利要求3所述的利用卵黄脂磷蛋白抗体定性检测鱼类卵黄原蛋白的试剂盒，其特征在于所述的鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体的制备方法如下：

采用腹腔注射雄性小鼠的方式，每只小鼠注射纯化的金鱼卵黄脂磷蛋白50μg，注射前将等体积抗原与弗氏完全佐剂充分混匀；此后，在第14、21、28、35、38天分别注射，注射剂量为50μg，注射前将等体积抗原与弗氏不完全佐剂充分混匀；第40天采血，采血前一天停食；采用眼眶取血法取血，获得抗血清用于制备鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体；

采用硫酸铵沉淀的方法制备鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体：首先将鼠抗血清与阴性对照血浆2:1混合，4℃摇晃过夜，离心去除非特异性的抗体，然后加入(NH₄)₂SO₄粉末至20%的饱和度，4℃摇晃2个小时，离心除去纤维蛋白；加50%的饱和硫酸铵，4℃摇晃2个小时，离心除去白蛋白；加33%的饱和硫酸铵，4℃摇晃2个小时；4℃，8000g离心10分钟，即获得鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体。

5.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒在环境雌激素类化合物的筛选，以及在水环境受雌激素类物质污染状况检测中的应用。

6.利用权利要求1所述的的试剂盒定性检测鱼类卵黄原蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将试剂盒中的金鱼卵黄脂磷蛋白纯品、阴性对照血浆和待测的雄鱼样品稀释后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述的待测的雄鱼样品包括血浆、匀浆液、体表黏液、肝脏组织及肝细胞培养液；

2)把电流凝胶上的蛋白转印到PVDF膜；

3)用封闭液封闭PVDF膜的非特异性结合位点，4℃孵育过夜，弃去封闭液；

4)加入用封闭液按1:300的体积比稀释的鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体，室温下震荡孵育4小时，弃去溶液，用洗涤液洗涤PVDF膜3次；

5)加入用封闭液按1:500的体积比稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，室温下震荡孵育4小时，弃去溶液，用洗涤液洗涤PVDF膜3次；

6)加入显色液，待蛋白质条带清晰后，弃去显色液，用蒸馏水终止显色反应，PVDF膜拍照后于避光处保存；

7)在雄鱼样品中发现有显色条带，表明该鱼生活的水域受到了环境雌激素类物质的污染。