[发明专利]一种用于糖蛋白富集的纳米金掺杂整体材料及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及功能化整体材料用于糖蛋白的富集，具体地说是一种纳米金掺杂整体材料的制备及其用于糖蛋白的高效高选择性富集。

背景技术

蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,据报道目前至少有50%的蛋白质发生了糖基化修饰，其对蛋白质的结构和功能有着重要的影响。然而，由于糖蛋白丰度低、糖肽占总肽段比例小，采用质谱分析检测时往往被高丰度的非糖肽掩盖，若不对糖蛋白进行富集，欲从复杂的生物样品体系中分析糖蛋白几乎是不可能的。文献报道中对糖蛋白常用的分离富集方法主要有凝集素亲和法、硼酸法、酰肼法和亲水作用法等。其中硼酸法是利用苯硼酸能与顺式二羟基化合物在碱性条件下结合形成稳定的络合物,当介质的pH切换为酸性时,络合物解吸释放出顺式二羟基化合物。苯硼酸作为糖蛋白富集的配基具有三个显著的优点:1)共价结合,亲和力强;2)可逆反应,结合/解吸过程容易控制;3)在酸性条件下解吸,解吸条件的质谱兼容，且不会破坏糖链结构，因此，近年来在糖蛋白富集中有很大的应用。

整体柱由于具有反压小，通透性好，易于实现在线等优势，其应用非常广泛。至今已有成功报道将苯硼酸配基利用共聚或后修饰方法固载于整体材料上，实现了对糖蛋白的有效富集（L Ren,Y Liu,M Dong,Z.Liu.J.Chromatogr.A.2009,1216,8421-8425；Z Lin,J Pang,H Yang,Z Cai,L Zhang,G.Chen,Chem.Commun.2011,47,9675-9677；Y Liu,L Ren,Z Liu.Chem.Commun.2011,47,5067-5069;Y Liu,Y Lu,Z Liu,Chem.Sci.,2012,3,1467-1471）。目前用于硼酸亲和柱的整体材料主要分两类：聚合物基质和硅胶材料基质。其中基于硅胶基质的整体材料比表面积比较大，但由于硅羟基的作用，其对蛋白质存在较强的的非特异性吸附，会影响富集的选择性，且硅胶基质的材料可耐受的pH范围很窄；而采用聚合物基质存在最主要的问题是其比表面积比较小，从而降低富集容量。因此，我们将纳米颗粒掺杂入亲水性整体材料用于富集糖蛋白，可显著提高富集容量及选择性。

发明内容

纳米金具有比表面积大，生物相容性好，稳定性好，易于修饰的优势，将其掺入整体材料中可显著增大比表面积，并且利用其易于修饰的特点可以制备含多种功能基团的整体柱。本发明的目的是提供一种亲水性好的整体基质载体，表面固载纳米金，进一步修饰巯基苯硼酸，从而制备出比表面积大、非特异性吸附小的硼亲和整体柱，用于糖蛋白质的高容量、高选择性富集。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

采用甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚乙二醇二丙烯酸酯作为单体，在石英毛细管内进行原位热聚合，得到亲水性聚合物整体基质，经环氧开环反应在聚合物基质表面引入巯基，然后在其表面固载纳米金颗粒，进一步在纳米金颗粒表面共修饰巯基苯硼酸和巯基乙胺。

所述苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体材料的制备，具体步骤如下：

（1）含环氧基团的亲水性整体材料基质的制备：以甲基丙烯酸缩水甘油酯（质量分数为20-30%（w/w））和聚乙二醇二丙烯酸酯（质量分数为10-20%（w/w））作为单体，加入致孔剂正丙醇和环己醇混合物（质量分数为50-70%（w/w）），以及引发剂偶氮二异丁腈（质量分数占单体总质量的0.05-0.1%（w/w））。震荡超声混匀，通氮气去除溶解氧，灌柱，加热聚合10-24小时后分别用纯甲醇和纯水冲出未反应发的试剂；

（2）基质表面修饰纳米金：向所制备的含环氧基团的毛细管整体柱中连续通入半胱胺溶液，于40-70℃下反应6小时，采用1M Tris-HCl（pH=8）缓冲溶液封尾2-4小时后用纯水冲洗柱子至中性，在室温下连续通入三羧甲基磷酸溶液还原二硫键，用纯水冲洗柱子；最后向富含巯基的整体材料中通入纳米金溶液；

（3）苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体材料的制备：向上述制备的纳米金掺杂整体材料中连续通入含4-巯基苯硼酸与巯基乙胺混合物室温下反应1-3天。

制备的苯硼酸修饰的纳米金掺杂整体材料用于选择性地富集糖蛋白。

本发明具有如下优点：

1.本发明采用含聚乙二醇链的亲水性单体聚乙二醇二丙烯酸酯作交联剂，制备的基质材料亲水性好，非特异性吸附小。

2.本发明采用纳米金掺杂整体材料，大大提高了材料比表面积，修饰上更多的功能基团苯硼酸，使其对糖蛋白的富集选择性高，容量高，且易于实现在线富集。