[发明专利]一种高效液相色谱法测定西瓜中瓜氨酸含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种瓜氨酸测定方法，具体涉及一种高效液相色谱法测定西瓜中瓜氨酸含量的方法。

背景技术

瓜氨酸，英文名称Citrulline，因其最初发现于西瓜汁而得名，是一种非蛋白质L-α-氨基酸，它具有肽键形成的能力，但不参与蛋白质的合成。瓜氨酸曾一度被人们认为是尿素循环的中间产物，然而，最近的研究表明，瓜氨酸能广泛应用于医药、食品保健等各个方面，具有良好的药理作用。瓜氨酸可以使人的血管获得松弛，用于增强男性性功能，以及治疗性功能障碍。维护健康的肺功能，提高脑力清晰度，有帮助脑神经细胞具贮藏与调回讯息的功能。

瓜氨酸的测定方法主要包括：分光光度法、酶-比色法、柱前衍生-高效液相色谱法。分光光度法主要是利用瓜氨酸结构的某官能团反应生成有色物质比色测定，由于某些物质具有相似结构，此法特异性较差，易造成假阳性影响实验结果；酶-比色法中，酶可以专一性酶解瓜氨酸，但酶制剂价格昂贵，限制了其在实际检测中的应用；柱前衍生方法，瓜氨酸与特定试剂发生衍生反应后，依靠液相色谱实现与其他物质的分离，方法较为准确可靠。田瑶等(中药新药与临床药理，2012，23(2)：180-183)公开了利用邻苯二甲醛(OPA)作为柱前衍生试剂，反相高效液相色谱测定家兔关节微透析液中精氨酸和瓜氨酸的方法；刘放南等(肠外与肠内营养，2004，11(2)：116-117)公开了将异硫氰酸苯酯(PITC)作为柱前衍生剂，反相高效液相色谱测定血清中瓜氨酸的方法。

本发明建立了一种新的瓜氨酸测定方法，9-羟基呫吨作为柱前衍生剂，采用液相色谱-荧光检测器检测，本方法具有前处理简单、基质干扰小、准确度高等特点，能够满足日常检测工作的需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于选择合适的溶剂，提取西瓜中的瓜氨酸，采用9-羟基呫吨作为衍生剂，酸性条件下进行衍生，降低基质干扰，开发一种新的测定西瓜中瓜氨酸的方法。

本发明所述的的技术问题可通过以下技术方案得以解决：

(1)准确称取1-2g去皮去籽粉碎后的西瓜样品于50mL离心管中，加无水乙醇至10mL，震荡提取20-30min；

(2)提取液在5000-8000r/min条件下离心3-5min，取上清液过0.45μm有机滤膜，得滤液；

(3)取上述滤液0.5-1.0mL于1.5mL进样瓶中，加入0.02mol/L 9-羟基呫吨衍生剂50-200μL，1.5mol/L盐酸25-100μL，使得衍生反应比例按体积比为：试样提取液∶0.02mol/L 9-羟基呫吨∶1.5mol/L盐酸＝10∶2∶1-20∶2∶1，混匀，室温条件下避光反应20-30min；

(4)衍生后的样液采用高效液相色谱法分离检测，外标法定量，计算西瓜中瓜氨酸的含量。

优选高效液相色谱条件：

色谱柱：以碳十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：乙腈+0.02mol/L乙酸钠水溶液(梯度洗脱，程序见表1)；

流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；

柱温：35℃；

激发波长：213nm，发射波长：308nm。

表1液相色谱梯度洗脱条件

时间/min乙腈/％0.02mol/L乙酸钠/％0.002080