[发明专利]定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖领域，具体涉及一种定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒及其应用。

背景技术

鱼类的发育分为仔鱼期、稚鱼期、幼鱼期、未成熟期、成鱼期和衰老期，各时期的划分与鱼类性腺的发育有着直接的关系，对于雌鱼而言，其卵巢中主要的物质为卵黄蛋白，卵黄蛋白在鱼类整个生命周期中起着重要的作用。首先，卵黄蛋白是受精卵的重要物质，为鱼类胚胎发育和仔鱼早期生长提供营养物质和能量来源。其次，在卵黄生成期，卵细细胞从血液中摄取卵黄原蛋白，经加工后以卵黄粒和油滴的形式储存于卵母细胞中，卵黄蛋白的含量直接影响胚胎的存活及仔鱼的生长发育。

卵黄原蛋白由雌鱼的肝脏产生，随血液循环到达卵巢，在组织蛋白酶D的作用下，迅速裂解成三种主要卵黄蛋白：卵黄脂磷蛋白、卵黄高磷蛋白和β’组分，储存于卵黄粒中，其中以卵黄脂磷蛋白的含量最为丰富。与卵黄原蛋白相似，卵黄脂磷蛋白也是一种典型的糖脂蛋白，并且含有少量的磷，在胚胎的生长和发育过程中具有多种生物学功能。在卵母细胞的成熟过程中，卵黄脂磷蛋白进一步裂解，释放出脂质，并产生游离氨基酸，为胚胎与稚鱼提供蛋白质合成的原料和有氧能量生产的主要底物，并且在特定的发育时期提供所需的脂质。目前已经研究了黑线鳕、条斑星鲽、杂交鲟等多种鱼类卵黄脂磷蛋白在卵母细胞或胚胎发育过程中变化，并证实卵黄脂磷蛋白通过降解成游离氨基酸，为早期胚胎和稚鱼的发育提供能量和营养物质；卵黄脂磷蛋白还具备调节渗透压的功能，在卵细胞的发育过程中，浮性卵因吸收水分，体积显著增大，发育成熟时，浮性卵中水分含量达到85~95%,卵细胞体积增大3~5倍，为胚胎的发育提供备用水。在这一过程中，游离氨基酸含量的增加，为产生水分流入所需要的渗透压起到重要作用，同时，水含量的增加提供了鱼卵漂浮在水体中所需的浮力。Reith等(2001)、Reading等(2009)和Ohkubo等(2006)证实，浮性卵中的游离氨基酸主要来源于卵黄脂磷蛋白的重链；此外，卵黄脂磷蛋白还具备免疫学功能，在大多数情况下，鱼类的受精和发育要在水环境中进行，而水中往往含有能够引起多种疾病的病原体，在发育初期，胚胎和稚鱼无法合成足够的免疫相关分子，也未形成淋巴器官。因此，在免疫系统发育成熟之前，只能依靠母系物质抵挡入侵的病原菌。师晓栋(2003)发现玫瑰无须鲃的卵黄脂磷蛋白能够抵制多种病原菌的生长；Zhang J和Zhang SC(2011)研究发现，玫瑰无须鲃的卵黄脂磷蛋白与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很强的结合能力，并能能够增强巨噬细胞的吞噬能力，推测卵黄脂磷蛋白既能够识别入侵的病原菌，又能诱发巨噬细胞消化病原菌，从而保护胚胎和稚鱼免受病害。

可见，研究鱼类的卵黄脂磷蛋白对了解鱼类早期发育状况具有极大帮助。目前，国内外已经报道了多种鱼类卵黄脂磷蛋白的纯化与鉴定方法，但大多采用其含有糖、磷、脂基团的特性，采用特异性染色或者分析其糖、磷、脂含量来确定其是否为卵黄脂磷蛋白。这种方法是费时、费力，并且非常不经济。

鲤科鱼类是鲤形目中分布最广、种类也最多的一群，全世界共有鲤科鱼类210属，2000种以上，都是淡水鱼类，在我国各大河流、湖泊中广泛分布，也是我国自古以来农家鱼塘中主要的养殖鱼种。因此，开发鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的检测试剂盒具有广泛的应用前景和科学价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒及其应用，以克服现有技术的不足。

一种定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒，包括一个盒体，该盒体内装有：1)PVDF膜2张；2)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗1支；3)封闭液、洗涤液、显色液各1支，所述的洗涤液为TBST；封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST；显色液为含0.06%(m/V)3’-二氨基联苯胺的10mM Tris-HCl；其特征在于该盒体还装有：4)金鱼卵黄脂磷蛋白纯品1支；5)鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体1支。

上述金鱼卵黄脂磷蛋白纯品为100μg/ml金鱼卵黄脂磷蛋白溶液。

上述定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒制备方法，包括以下步骤：1)制备金鱼卵黄脂磷蛋白纯品；2)利用步骤1)得到的金鱼卵黄脂磷蛋白纯品制备鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体；3)将步骤1)得到的金鱼卵黄脂磷蛋白纯品1支、步骤2)得到的鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗血清1支、PVDF膜2张，以及封闭液、洗涤液、显色液和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗1支共同装入盒体，得到鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白定性检测的试剂盒。

上述试剂盒在定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白中的应用。