[发明专利]表达61家族糖苷水解酶基因的毕赤酵母工程菌株

说明书

（一）技术领域

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达具体地说是以嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus 61家族糖苷水解酶基因61f的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-TA-61。

（二）背景技术

糖苷水解酶（英语：Glycoside hydrolases，又称糖苷酶）是一种专门水解配糖键（glycosidic bond），并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。

嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶和61家族糖苷水解酶。

嗜热子囊菌光孢变种产生的61家族糖苷水解酶61F具有微弱的纤维素酶活性，但对该菌株产生的内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用,可使其活性提高3.89倍。在不同金属离子如Mn²⁺的作用下，61F和61F+N24的活性可分别提高20倍和1.2倍。

（三）发明内容

本发明从嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus获得内切β-1,4-葡聚糖酶基因的全长cDNA序列，命名为61f，61f基因cDNA全长1325bp，包括起始密码子和多聚A尾，具有一个747bp的开放阅读框，编码249个氨基酸。具有信号肽序列（1-21aa MSFSKIIATAGVLASASLVAG）及一个潜在的N糖基化位点（NNS）。

将61f编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第61家族，其中3个基序GNYV-RHE，GAQNYPQC和Y-IPGP具保守性。与丝状真菌亚西岛篮状菌Talaromyces stipitatus、马尔尼菲青霉菌penicilliummarneffei的内切葡聚糖酶的同源性较高，分别达到74%和75%。

构建重组表达质粒载体pPIC9K/61f，利用电转仪进行电击转化pichiapastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-TA-61。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28℃200 rpm/min摇床培养6d后，61家族糖苷水解酶的表达量为3.22mg/ml，分子量为29KDa，酶活力为0.0667U/ml，61F在65℃下是稳定的，处理60min后仍有95%以上的酶活性；70℃处理60min后仍保持67%的活性；75℃的半衰期为40min；80℃处理10min后保持40%的活性；90℃处理50min活性几乎完全丧失。

61家族糖苷水解酶61F对嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.Levisporus内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，混合酶比原始酶N24的降解纤维素的能力提高3.89倍。不同金属离子对61F和61F+N24混合酶活性具有促进或抑制作用，其中在Mn²⁺条件下，61F和61+N24的纤维素酶活性可分别提高20倍和1.2倍。

（四）附图说明：

图161家族糖苷水解酶61F的SDS-PAGE分析

泳道1：低分子量蛋白标准

泳道2：纯化的61家族糖苷水解酶61F

图261家族糖苷水解酶61F对内切纤维素酶N24活性的促进作用

图3不同金属离子对61F纤维素酶活性的影响

图4不同金属离子对混合酶的作用

（五）具体实施方式

实施例1：嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus的分离鉴定

（1）标本采集：从堆肥中采集。

（2）分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。

（3）鉴定:参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。

实施例2：糖苷水解酶基因61g的克隆