[发明专利]一种诱导免疫耐受融合肽构建

说明书

技术领域：本发明属于自身免疫性疾病、器官移植诱导免疫耐受治疗技术领域，具体涉及抗原肽，蛋白酶切功能基因选择、基因重组、融合蛋白构建方法。

背景技术：如何诱导宿主免疫耐受是治疗免疫调节异常性疾病(如炎症性肠病)以及异体抗原导致的免疫排斥反应(器官移植排斥)是目前免疫学领域的热点和难题。目前研究诱导免疫耐受存在以下问题：1，受体在接受供体抗原刺激后，产生为自然调节T细胞和B细胞，再次接触抗原增殖和免疫调节能力有限。2，供体抗原通过抗原提呈细胞(APC)被树突状细胞(DC)摄取，DC细胞分泌特异性TGF-β诱导Treg产生，然而目前研究表明，之所以未诱导出相当数量的Treg产生，是由于DC细胞产生的TGF-β与一肽段相连(Latent TGF-β)无法发挥功能。既往有人研究使用蛋白酶切断该肽段，但是何种蛋白酶能切断该肽段目前不明确；新的蛋白如果不是受体所本生存在的，又导致DC细胞产生免疫反应。

肠道作为第二大免疫器官，每日吸收来自外源的大量各种各样的蛋白而能被吸收而不产生排斥反应，这种现象称为口服耐受(口服耐受是一个全身耐受反应)。通过前期研究发现肠道共生菌在口服耐受中作用明显，而且口服耐受机理可能为肠道共生菌能分泌一种特殊蛋白酶将Latent TGF-β中的肽段切断，使之成为功能性TGF-β诱导免疫耐受。本实验室通过反复筛选，发现bifidobacterium infantis能诱导Treg产生，通过序列比对和生物信息学分析，发现该细菌CLPP1基因表达的蛋白酶有在体外切断LatentTGF-β中的肽段的功能。因此本专利通过基因工程的方法将CLPP1基因与特异性抗原(allo-MHC peptide)连接起来，形成新的融合蛋白，通过诱导特异性的诱导调节T细胞和B细胞产生，诱导免疫耐受。

人类免疫缺陷病毒HIV-1中TAT(Trans-activatortranscription)蛋白的蛋白功能区，称之为PTD区段(Protein transductiondomain)，能够有效的引导肽段或者蛋白质进入细胞，具有蛋白传送功能。TAT蛋白PTD的核心序列由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR，TAT的11个氨基酸转导序列是目前为止所发现的TAT PTD最短的序列，其转导能力并不比全长TAT序列转导能力差，其特点是转导速度快，效率高。

CLPP1基因是肠道双歧杆菌(bifidobacterium infantis)中能根据本实验是研究能表达蛋白酶体外切断Latent TGF-β中的肽段，使之变为有功能TGF-β，从而诱导调节性T细胞及B细胞产生而诱导免疫耐受。

发明内容：

本发明针对上述背景，提供了一种诱导免疫耐受融合肽的构建。其技术方案如下：

将TAT蛋白核心氨基酸序列的基因编码序列、CLPP1结构域编码基因序列和特异性抗原肽编码基因序列，通过基因合成的方法连接在一起，三者间通过特异性酶切位点编码基因序列相连接，将基因合成产物插入表达载体pET32a中，表达、纯化融合肽调节性T细胞及B细胞在诱导免疫耐受具有关键作用。抗原提呈细胞接触特异性抗原后可产生抗原特异性的杀伤性T细胞和调节性T细胞及B细胞。抗原被DC细胞摄取后，提呈抗原肽给CD4细胞，同时分泌细胞因子TGF-β1，INF-γ，TNF-α，CD4细胞必须获取抗原时同时获取细胞因子刺激时才能增殖，在免疫学里叫免疫共刺激现象，例如CD4细胞获取抗原同时被INF-γ刺激就会产生Th1细胞，被TNF-α刺激就会产生Th2细胞，这两种细胞主要介导排斥反应，如果被TGF-β1刺激就变成Tregs诱导免疫耐受，同时TGF-β1还有抑制INF-γ，TNF-α的作用。但是DC细胞分泌出来的TGF-β1是未成熟的LTBP，未成熟TGF-β1功能低下导致Tregs产量很低。CLPP1基因是肠道双歧杆菌(bifidobacterium infantis)中能根据本实验是研究能表达蛋白酶体外切断Latent TGF-β中的肽段，使之变为有功能TGF-β，从而诱导调节性T细胞及B细胞产生而诱导免疫耐受。TGF-β1通过一系列信号途径导致FOXP3的产生，从而产生FOXP3+CD4+T细胞，FOXP3+CD4+T细胞在产生后迁移到淋巴结发育成熟变成FOXP3+CD4+CD25+T的细胞，如果下次在识别抗原，就会大量扩增繁殖，发挥免疫调节功能。

有益效果：