[发明专利]一株产γ-聚谷氨酸基因工程菌及其高产γ-聚谷氨酸方法

说明书

技术领域

本发明涉及一株利用基因工程技术改造的高产γ-聚谷氨酸工程菌株及其利用该工程菌株发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，属于生物工程技术领域。 

背景技术

γ-聚谷氨酸（聚-γ-谷氨酸，poly-γ-glutamic acid，简称PGA）是一种由微生物合成的氨基酸聚合物，由L-或/和D-谷氨酸通过γ-聚谷酰键连接而成，其分子量一般在100～1000KDa之间，相当于500到5000个左右的谷氨酸单体。γ-聚谷氨酸具有优良的成膜性、成纤维性、可塑性、粘结性和极其强的吸水性，具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保温、缓释、助溶、粘结和强吸水等功能。作为一种生物材料，γ-聚谷氨酸具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒害等优点，在食品、化妆品、医药、农业和水处理等领域具有广泛的应用前景。 

近来国内外主要选用以芽孢杆菌为代表的微生物发酵法来生产γ-聚谷氨酸。早在1937年由Ivanovics首先在Bacillus anthracis的荚膜中发现了γ-聚谷氨酸，此后微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸有了一些尝试性研究。特别是二十世纪九十年代后，在分离筛选以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis为代表的γ-聚谷氨酸高产菌株方面做了大量的科学实验。Kubota从土壤中分离得到的一株Bacillus subtilis F201，该菌株在最佳发酵生产条件下可以达到50g/L的最高产量，该菌株已被Meiji Seika Kaisha公司成功用于工业化大规模生产γ-聚谷氨酸。Ogawa对 Bacillus subtilis MR 141进行培养条件优化，在30L的发酵罐中可使γ-聚谷氨酸最大产量达到35 g/L。Yoon对Bacillus licheniformis ATCC9945a采用流加高密度培养的方法，在2.5 L发酵罐中发酵35小时后达到39 g/L的最终产量。国内有研究报道在适量谷氨酸供给条件下，取得产量30 g/L，有望成为生产用株。日本味之素株式会社和台湾味丹企业已经利用发酵方法方法进行PGA的商业化试生产。 

目前发酵法生产γ-聚谷氨酸过程中，合成代谢途径较为复杂，发酵液中PGA浓度相对较低，并且发酵液及其粘稠，粘度达到数千毫帕秒，发酵液高粘度显著降低了发酵液中的溶氧浓度，形成了低氧环境，非常有限的可利用氧成为限制生产菌种生产和代谢的关键性因素，极大地影响了菌株的代谢生长，降低了γ-聚谷氨酸合成分泌量，导致γ-聚谷氨酸产率较低。因此寻找一种能够增加发酵液中溶氧浓度的方法或是提高微生物在贫氧环境下的摄氧能力，成为目前γ-聚谷氨酸发酵生产中亟待解决的问题。 

透明颤菌血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin, VHb）是由一种专性好氧的革兰氏阴性菌透明颤菌（Vitreoscilla sp．）的血红蛋白基因（Vitreoscilla hemoglobin gene，vgb）编码的同型二聚体形式的可溶性血红蛋白分子，在缺氧条件下合成的一种可溶性血红蛋白，是原核生物中迄今为止发现的唯一一种血红蛋白。由于它具有较强的氧传送能力，可以在贫氧环境中促进细菌生长，因此利用透明颤菌血红蛋白基因（vgb）在发酵菌株中的表达血红蛋白（VHb），能够有效地解决好氧微生物发酵过程中的供氧问题，在不增加投资的情况下，达到提高产量的目。本发明正是基于以上的原理，构建了可表达透明颤菌血红蛋白的γ-聚谷氨酸工程菌株，该工程菌以补料方式发酵培养可高效高产γ-聚谷氨酸。 

发明内容

本发明的目的在于提供一株利用基因工程技术改造的高产γ-聚谷氨酸工程菌株及其利用该工程菌株发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，改造后经独特的流加补料方式发酵培养，生产聚谷氨酸能力较改造前提高了147%。 

本发明以一株产γ-聚谷氨酸的野生枯草芽孢杆菌作为遗传改造改造对象， 经基因工程技术改造后获得的一株高产γ-聚谷氨酸工程菌FRD518，该基因工程菌为同源重组菌，染色体上重组了含有启动子P43、同源重组序列amyE和氯霉素抗性筛选标记的透明颤菌血红蛋白基因vgb等序列的重组载体，重组基因工程菌能成功高表达血红蛋白活性，提高贫氧条件下该菌的摄氧能力和代谢能力，在较低溶氧水平下，大幅度提高γ-聚谷氨酸的产量。