[发明专利]鸡血中抗菌肽的提取方法

说明书

 

技术领域

本发明属于抗菌肽的提取方法，具体涉及一种鸡血中抗菌肽的提取方法。

 

背景技术

抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类分子量在4KD左右，具有抗菌活性的碱性多肽物质。迄今为止，在不同动物组织中已发现了很多具有抗菌作用的蛋白质和多肽，已有70多种抗菌多肽的结构被测定，抗菌肽的概念得到了极大的扩展。

抗菌肽是生物体内诱导表达具有广谱抗菌活性的小分子多肽。这些多肽是生物体非专一性的免疫应答产物，是生物体内免疫系统的重要成分。国内外关于鸡源抗菌肽的研究，主要针对鸡小肠中的抗菌肽，而血中抗菌肽的提取及抗菌活性研究在国内外却很少有报道。目前，我国鸡的饲养量很大，屠宰鸡的下脚料鸡血很多，对其进行抗菌肽的提取和研究，是对资源的利用和再开发，是很有必要的。

 

发明内容

为了克服现有技术领域存在的上述问题，本发明的目的在于，提供一种鸡血中抗菌肽的提取方法，解决目前对鸡血进行抗菌肽的提取和研究较少的问题。

本发明提供的鸡血中抗菌肽的提取方法，它包括如下具体步骤：

（1）    鸡血采集：从屠宰场采取新鲜鸡血2-3L,使用5%柠檬酸钠抗凝；

（2）    萃取：将新鲜鸡血放置37℃温箱静置1-2h，取上清按照1：4的比例加入0.84%氯化铵溶液，混匀静置3min，常温400r/min离心10min，弃上清按比例加入氯化铵溶液混匀静置3min，再次500r/min离心10min；弃上清，使沉淀与少量4℃的生理盐水短时间混合，再用200ml的4℃的10%冰醋酸使沉淀悬浮，充分混匀，倒入50ml烧杯，超声波处理50次，然后溶液使用磁力搅拌器混匀搅动于4℃下萃取一夜；次日，将萃取的溶液取出15000r/min离心30min，取上清4℃下保存，沉淀再次混悬于冷的10%醋酸中，充分混匀，混匀搅动于4℃下萃取一夜；第三天将萃取的溶液取出15000r/min离心30min，最后将溶液4℃下保存；

（3）    除酸、浓缩：合并所保存的溶液,将溶液注入透析袋,扎紧袋口,然后将其放入烧杯,再向烧杯中倒入蒸馏水,蒸馏水液面要超过透析袋，4℃下透析除酸，每12h换水一次，直至透析袋外蒸馏水pH大于6，将透析袋放入瓷盘中，撒上聚乙二醇6000,透析浓缩约3-4h后即可将透析袋取出，将浓缩的溶液取出低温冻干，转移至青霉素小瓶中,密封-20℃保存；

（4）    抗菌肽的分离：将冻干样品用0.5%甲醇溶解,再上样于层析柱葡聚糖凝胶SephadexG25，同时打开柱的下端出口，注意控制流速为1mL/min，5mL/管，用部分收集器收集洗脱液，5mL/管，收集的溶液用紫外分光光度计测其在280nm处的吸收值，将在280nm处有吸收的溶液分装于青霉素瓶中，再在低温冻干机中冻干，-80℃保存，取各瓶冻干保存的样品各20mg，分别溶于灭菌双蒸水中,无菌条件下用微孔滤膜过滤样品,将药敏纸片浸泡于过滤后的样品中,浸泡过夜后,用平皿纸片法初筛，收集具有抗菌活性的组分，置于5℃保存；

（5） 抗菌肽的纯化与浓缩：使用超滤装置进行超滤，膜包选用截流分子量为20kD，洗脱液选用0.5%甲醇溶液，滤出液既为所要获得的溶液。

本发明提供的鸡血中抗菌肽的提取方法，其有益效果在于，本提取方法简单易懂，提取的抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有高效广谱的杀伤作用，纯化产物的抑菌效果高于6000单位青霉素的抑菌效果，粗提物和纯化物对大肠杆菌均有着较强的抑菌效果。

 

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明提供的鸡血中抗菌肽的提取方法，进行详细的说明。

实施例

本实施例的鸡血中抗菌肽的提取方法，它包括如下具体步骤：

（1）    鸡血采集：从屠宰场采取新鲜鸡血2-3L,使用5%柠檬酸钠抗凝；