[发明专利]单克隆抗体间接免疫荧光检测附红细胞体病的方法

权利要求书

1.一种单克隆抗体间接免疫荧光检测附红细胞体病的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）标准阳性对照和阴性对照的设立，将自然感染率达90％以上，且经瑞氏、姬姆萨和吖啶橙染色检测均为阳性的猪血作为标准阳性抗原对照；将来自西藏地区且经压片、瑞氏、姬姆萨和吖啶橙染色及PCR检测均为阴性的猪血作为阴性对照；

（2）抗原包被，取标准阳性和阴性血样涂片，晾干，并设空白对照；

（3）荧光二抗的稀释，分别用0.01％ 的伊文思蓝和0.01 mol／L PBS稀释FITC标记的山羊抗鼠IgG抗体；

（4）IFA测定，将已包被好的两组标准阳性和阴性对照的玻片，用冷丙酮和甲醛等比例混合液固定15 min，室温下干燥，加入相应编号的抗猪附红细胞体的单克隆抗体20 L，置湿盒中37℃下作用30 min，用PBS轻轻冲洗，然后浸泡于PBS盒中，于电动摇床上轻微摇动，连续洗涤3次，待免疫荧光片干燥后将其中一组标准阳性和阴性抗原及空白对照玻片中加入10 L用0．01％伊文思蓝稀释的荧光抗体；另一组加入10L用0．01mol／LPBS稀释的荧光抗体，置湿盒中37℃下作用30 min，用PBS轻轻冲洗，然后浸泡于PBS盒中，于电动摇床上轻微摇动，连续洗涤3次，待干燥后滴加甘油-PBS缓冲液，覆加盖玻片，置荧光显微镜下观察。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体间接免疫荧光检测附红细胞体病的方法，其特征在于：所述步骤（1）中所用的瑞氏、姬姆萨和吖啶橙染色方法步骤如下：

（1）瑞氏染色，取一洁净载玻片，以其右端1/3蘸血一滴，作血涂片，自然晾干后滴加瑞氏染液1min，加等量0.01mol/L PBS(PH6.4)混匀，染色3-5min，水洗，室温干燥后镜检；

（2）姬姆萨染色，作血涂片，自然晾干后用甲醇固定2-3min，加姬姆萨染液15-30min，水洗，室温干燥后镜检；

（3）吖啶橙染色，做血涂片，自然晾干后用95%乙醇固定15-30min，滤纸吸干，1%醋酸作用30s,PBS清洗1min，于0.01%吖啶橙染液中染色1-5min，PBS清洗1min,用0.1mol/L CaCl2分色0.5-2min,PBS清洗3次，每次数秒，甘油和PBS等比例混合封片，立刻于荧光显微镜下观察。