[发明专利]游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备和检测方法

权利要求书

1.一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：

第一试剂：含荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体、pH为7.0-9.0的缓冲溶液，所述的荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的浓度为0.5~1μg/mL；

第二试剂：含碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体、pH为7.0-9.0的缓冲溶液，所述的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的浓度为0.5~1μg/mL；

磁分离试剂：含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。

2.根据权利要求1所述的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体由碱性磷酸酶与游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体通过交联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物和2-亚氨基四氢噻吩连接构成。

3.根据权利要求1所述的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述的包被着荧光素抗体的磁微粒中，荧光素抗体与磁微粒之间化学偶联。

4.一种如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述的第一试剂、所述的第二试剂以及所述的磁分离试剂的步骤，其特征在于：所述的第二试剂的制备方法如下：

（1）使游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体与交联剂2-亚氨基四氢噻吩在甘氨酸溶液中，室温静置反应，生成游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物，于2-8℃下保存备用；

（2）使碱性磷酸酶溶液与交联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物溶液混合，室温静置反应，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，将收集到的碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物于2-8℃下保存备用；

（3）将步骤（1）所得溶液与步骤（2）所得溶液按照游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物与碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物的摩尔比为1:1~2混合，在2-8℃下反应，使生成所述的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体，反应结束，将反应液通过Supperdex200凝胶纯化柱纯化，选择合适的pH缓冲液调整浓度和pH值即得所述的第二试剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体、所述的碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg，所述碱性磷酸酶的缓冲液的浓度超过5mg/ml。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的第一试剂的制备方法如下：配制含有荧光素的pH为9~10的缓冲液，然后按照荧光素与游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的分子比为20~200:1的比例，将所述含有荧光素的pH为9~10的缓冲液与游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体混合，室温静置反应，将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，获得荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的溶液，接着用具有适当的pH值的缓冲液调整浓度和pH，即得所述第一试剂。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的磁分离试剂的制备方法如下：使含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂的存在下，室温反应2~12小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当pH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述磁分离试剂。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为0.5~2微米，每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于0.4mmol；所述的荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万；所述的偶联剂为碳二亚胺。