[发明专利]用于检测I型单纯疱疹病毒的引物组及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于感染性眼病常见致病微生物的快速检测技术领域，具体涉及一种用于检测I型单纯疱疹病毒的引物组及试剂盒。

背景技术

单纯疱疹病毒属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科的具有代表性的疱疹病毒，根据抗原性的差别分为I型和II型两种血清型，目前认为包膜糖蛋白G是I型和II型间差异最大的一个糖蛋白，可诱导机体产生型特异性抗体反应。单纯疱疹病毒能引起人类多种疾病，而常见的病毒性角膜炎主要由I型单纯疱疹病毒感染角膜所致。I型单纯疱疹病毒通过分泌体液和亲密接触粘膜表面或擦伤皮肤而在人与人之间传播，原发感染通常是无明显症状的，但病毒从此可在宿主体内潜伏。当机体受到多种因素如紫外线（太阳暴晒）、发热、创伤和情绪紧张、细菌或病毒感染以及使用肾上腺素等影响后，潜伏的病毒被激活，激活的HSV-1复发感染可以引起眼部病变，反复复发还可以引起角膜瘢痕形成、新生血管化，甚至失明。单纯疱疹病毒性角膜炎临床表现复杂，除了典型的树枝、地图及盘状角膜病灶形态外，还有一些不典型的临床改变，给诊断和治疗带来很大困难。近年来单纯疱疹病毒型角膜炎有明显上升和加剧趋势，由于反复发作，重症病例增多，严重威胁视功能。因此只有早期及时确诊是由哪种病毒感染所致，才能更好的指导后续治疗中的合理用药以及选择合适的手术时机。

目前临床上主要通过典型的角膜病灶形态（树枝、地图及盘状）、多次复发的病史、抗生素治疗无效而皮质激素治疗恶化，以及角膜感觉迟钝或消失等临床症状对单纯疱疹病毒型角膜炎进行确诊，但是其临床表现毕竟复杂多样，而且此过程有一定的主观依赖性，所以单纯的靠临床表现进行确诊还是存在一定的难度。实验室诊断目前主要有病毒分离培养法和荧光抗体染色技术。从病变样本中进行病毒的培养是明确诊断的最可靠依据，但是这种培养方法耗时长，不能提供早期诊断结果，延误治疗；由于患者之前的用药还可能会影响培养的阳性；而且培养病毒也需要专业技术人员和硬件条件的完善。对病变部位细胞直接印迹然后行荧光抗体染色可以在较短时间内做出判断，但是此法检测的阳性率较低，还需要专业的荧光显微镜。可见对I型单纯疱疹病毒引起的眼部感染目前尚无快速有效的早期诊断方法，因此临床上亟需新的快速有效的病毒性角膜炎的诊断方法。利用分子生物学方法诊断病原微生物为单疱病毒性角膜炎的快速诊断提供了新的思路。已有研究者将普通PCR的方法应用于细菌、真菌和病毒引起的感染诊断，对细菌的16S rRNA、真菌rRNA基因的大、小亚基和病毒种特异性序列进行扩增和分析，可有效鉴定至种属。普通PCR方法诊断病原虽然高效特异，但要先对样本进行模板DNA的提取，这个过程本身就会造成样本的损失；加上临床眼科病变样本量本来就很少，即使采用高效便捷的试剂盒提取方法，DNA得率依然是很低的。所以考虑到要进行DNA提取，那么普通PCR难以适应临床需要。直接PCR方法就可以避开DNA提取的步骤，将临床样本直接进行I型单纯疱疹病毒特异性DNA的扩增，既大大缩短了检测的时间，又高效特异，而且需要的话还可以进一步进行基因型的鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测I型单纯疱疹病毒的引物组及试剂盒，能够快速、高效、准确地检测I型单纯疱疹病毒，同时省去临床病变样本DNA提取步骤，使得检测更加便捷，从而弥补现有技术的不足。

本发明根据GenBank中所公布的不同株I型单纯疱疹病毒包膜糖蛋白G的核酸序列中同源性较高的部位，设计并合成型特异性的引物组。

本发明的用于检测I型单纯疱疹病毒的引物组，其核苷酸序列为分别为SEQ ID NO：1～2，单疱病毒扩增片段长度为346bp；其中：

正向引物HSV-1F：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

反向引物HSV-1R：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的I型单纯疱疹病毒快速检测试剂盒包括：

1）DNA扩增试剂：

DNA扩增试剂包含有2×MightyAmp 缓冲液、 MightyAmp DNA聚合酶；

2）正反向引物组合：

正反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，反向引物的序列为SEQ ID NO：2。

3）阳性对照核酸：

阳性对照核酸为含有I型单纯疱疹病毒序列的质粒pUC-HSV-1；

4）灭菌蒸馏水。

利用本发明的检测试剂盒对病毒性角膜炎的临床样本进行I型单纯疱疹病毒检测的方法：