[发明专利]CDKN1B基因突变检测特异性引物和液相芯片

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种CDKN1B基因突变检测特异性引物和液相芯片。

背景技术

CDKN1B基因全称周期蛋白依赖激酶抑制因子1B（cyclin dependentkinase inhibitor 1B，CDKN1B），又称为p27，Kip1，定位于12号染色体12p13.1-p12短臂上，是一种调控细胞周期并抑制细胞分裂的重要基因。CDKN1B基因编码的P27蛋白为细胞周期素(cyclin)依赖性蛋白激酶抑制因子，其编码的蛋白质含有198个氨基酸，相对分子质量约27×10³，由2个外显子和2个内含子组成。P27蛋白质N端没有结构锌指的结构域，C端有2个分开的核定位信号。p27主要与cyclin结合而发挥对cyclin2CDK的抑制作用,具有多种生物学功能：(1)可直接抑制cyclin2CDK复合物的生物学活性，从而阻止细胞由G1期向S期的转变，同时还可作为细胞外刺激信号的潜在媒介来调控细胞周期。(2)促进细胞分化，介导细胞间黏附及诱导细胞凋亡。Gardner等发现，缺氧可诱导p27的产生，抑制CDK2的活性，从而阻滞细胞周期，如减少或清除p27将清除缺氧所致的G1期阻滞，但也有p27抑制细胞凋亡的报道。p27诱导还可抑制细胞凋亡，可能与细胞类型、生长状态及其恶性化与否有关。(3)与细胞衰老有关。Tsukiyama等发现，CD4与CD8-的胸腺细胞和激活的成熟T细胞的p27表达下降，人为上调p27表达后，可引起胸腺细胞发育障碍和成熟T细胞增殖能力下降，推测p27表达下降对T细胞的发育、增殖及免疫反应是必需的。研究表明，pRb导致细胞衰老可因p27表达减弱而丧失，pRb可能通过转录后的调节上调p27表达，并特异性地抑制CDK2活性来延长细胞周期阻滞，从而实现其诱导衰老的作用。p27作为细胞周期的负性调节因子，被认为是一种抑癌基因。大量研究发现，p27基因多态性位点与甲状腺乳头状癌、心肌梗塞、子宫内膜癌、卵巢癌的发生呈现显著相关性。

目前，CDKN1B基因突变检测方法主要有：PCR-RFLP技术、荧光定量PCR技术和Affymetrix 芯片技术，PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高的特点，但也存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种突变类型。虽然高通量是Affymetrix芯片技术比较成熟,然而该芯片技术对于中低密度的临床诊断型芯片并不合适,很难在同一个反应体系中扩展检测众多生物学性状相关的SNP或标签SNP。另外，Affymetrix芯片主要在表达谱芯片上比较强，物种较多，在SNP 芯片上相对较弱，而且检测价格昂贵，并不能满足实际需要。

发明内容

本发明的目的之一是提供CDKN1B基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测CDKN1B基因三种常见基因型G-79A、G-838T和T326G的野生型和突变型。

实现上述目的的技术方案如下。

一种CDKN1B基因突变检测液相芯片，包括有：

（A）.针对CDKN1B基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为：针对G-79A位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8，针对G-838T位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10，和/或针对T326G位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；

（B）.有不同anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.18，且所述anti-tag序列能相应地与（A）中所选的tag序列互补配对；

（C）.用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。