[发明专利]一种β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-fructofuranosidase,EC 3.1.2.26，简写为FFase）的制备方法，尤其是一种β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法。

背景技术

低聚果糖（fructooligosaccharides）是一种新型的保健食品，是功能性低聚糖中颇具代表性的一种。低聚果糖是通过β-（2，1）糖苷键在蔗糖的果糖基上连接1~3个果糖基而形成的一系列果糖寡聚体，主要包括蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）。日常食用的蔬菜与水果中含有此类寡糖，尤其是洋葱、牛蒡、芒笋和麦类中含量较高。低聚果糖具有低热值、预防龋齿、增殖肠道内的双歧杆菌、调节机体免疫力等生理功能，被广泛应用于食品、饲料和医药工业，是一种重要的保健型添加剂。

目前工业上生产低聚果糖方法主要有两种：一是以菊芋为原料提取菊粉，再经酶水解而得。第二种方法是以蔗糖为原料，采用β-D-呋喃果糖苷酶作为生物催化剂通过酶促催化一系列转糖基反应而获得低聚果糖。后一种方法中可以通过将β-D-呋喃果糖苷酶固定化而实现连续生产，具有自动化程度高、操作稳定性好、酶能反复使用、生产成本低等优点而受到青睐，国内外市场上的大多数低聚果糖产品都是采用这种方法生产出来的。

β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-fructofuranosidase,EC 3.1.2.26，简写为FFase）又称蔗糖酶或转化酶，可以催化水解β-D-果糖苷键，也可以催化转糖基反应。它广泛地存在于生物界，据文献报道，植物中的FFase催化活性很弱，产率低，且受到季节限制，而来自微生物的FFase比植物的催化活性高，且耐高温，反应过程中受杂菌的污染机会少，使用方便。能产生FFase的微生物主要有黑曲霉、米曲霉、酵母以及节杆菌等。微生物产FFase转糖基活力的高低和发酵制备的难易程度是决定酶转化法制备低聚果糖工艺是否经济的关键因素。

但是，目前对微生物源特别是曲霉来源的FFase发酵制备主要采用液体深层发酵法，存在发酵周期长（一般要7天左右）、发酵产酶水平低、废水排放量大、生产成本高等缺点给实际工业生产带来很多困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种单位基质酶活力高、发酵周期短、工艺简单、生产成本低的β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法。

一种β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法，其特别之处在于，包括如下步骤：

（1）孢子液的准备：首先制备试管斜面培养基，将黑曲霉接种到制备好的试管斜面培养基上，在25-32℃培养3～5天至长出孢子，然后向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液；

（2）种子的扩大培养：制备液体种子培养基，按照体积比2%～5%的接种量将步骤（1）得到的孢子液接入液体种子培养基，于25～32℃、转速180～220rpm的摇床上扩大培养2～4天，获得种子液；

（3）固态发酵产β-D-呋喃果糖苷酶：制备固态发酵培养基，将种子液接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度1～3厘米、湿度45%～80%、发酵温度25-35℃下静置发酵3～5天；

（4）后处理获得β-D-呋喃果糖苷酶：取步骤（3）得到的固体培养物，加入其6-10倍重量的50毫摩尔pH 5.5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提至少4小时，经过离心或过滤使固液分离，得到的上清液或滤液即为粗β-D-呋喃果糖苷酶酶液。

步骤（3）中固态发酵培养基的制备方法是将1.5～3倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，然后在121℃灭菌20分钟即可，其中营养液的组成以g/L计为，甘蔗糖蜜10～30，玉米浆5～15，脱脂奶粉3～10，硝酸钠1～3，磷酸氢二钾2～5，硫酸镁0.5，氯化钾0.5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到1升即可；固体混合物是由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其组成按照重量比为甘蔗渣：稻壳：大豆饼为3～6：1～3：0.5～1.5。

步骤（1）中试管斜面培养基的组成以g/L计为，蔗糖30，硝酸钠3，磷酸氢二钾1，硫酸镁0.5，氯化钾0.5，硫酸亚铁0.01，琼脂15，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到1升即可。

步骤（1）中黑曲霉为黑曲霉AS 3.877。

步骤（2）中液体种子培养基的组成以g/L计为，甘蔗糖蜜20，蛋白胨10，酵母膏5，硝酸钠2，磷酸氢二钾3，硫酸镁0.5，氯化钾0.5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到1升即可。