[发明专利]人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将手术切除边缘肺组织剪碎，BSS洗涤，经细胞筛过滤，留取筛网上组织；

(2)加入25-35ml组织消化液，36-38℃消化35-55min，在后10-20分钟加入1-2ml浓度为10⁴U/mL的Dnase I；每L所述组织消化液的组成为：浓度为10⁵U/mL的胰酶2-3ml，浓度为44.5mg protein/mL的弹性蛋白酶200-500ul；

(3)加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化，滴管吹打，得到细胞悬液；加入BSS稀释细胞悬液，经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞；每L所述抑制液的组成为：DMEM/F-1230-60ml，FBS10-20ml、浓度为10⁴U/ml的DNase I1-2ml；

(4)采用36-38℃预热的粘附培养基重悬细胞，置于36-38℃、3-5％CO₂、相对温度90-95％的环境下培养2-3h，轻柔收取未贴壁的细胞再次差速贴壁2-3h；每L所述粘附培养基的组成为：DMEM/F-1222.5-45ml、SAGM22.5-45ml、FBS5-10ml、浓度为10⁴U/ml的DNase I1-2ml；

(5)离心收集未贴壁细胞，用DMEM/F-12重悬细胞，并吹打均匀，缓慢加入轻、重分离液的顶部，密度梯度离心；所述轻、重分离液的体积比为1∶1；所述轻、重分离液的密度分别为1.040g/ml和1.089g/ml；

(6)滴管吸出轻、重分离液界面处的细胞层，BSS洗涤；Anti-CD14MicroBeads分选去除巨噬细胞，得到分选液；

(7)离心分选液收集细胞，用36-38℃预热的含1％FBS的SAGM重悬细胞，吹打均匀后加入SAGM完全培养基中，在36-38℃、3-5％CO₂、相对温度90-95％的环境中培养55-75h后换SAGM完全培养基，去除未贴壁细胞，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得人肺泡II型上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中，每L所述组织消化液的组成为：浓度为10⁵U/mL的胰酶2-3ml，浓度为44.5mg protein/mL的弹性蛋白酶300ul。

3.根据权利要求1所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述细胞筛为串联的100目、200目和325目细胞筛。

4.根据权利要求1所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述再次差速贴壁的时间为2.5h。

5.根据权利要求1所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，每L所述粘附培养基的组成为：DMEM/F-1222.5ml、SAGM22.5ml、FBS5ml、浓度为10⁴U/ml的DNase I1ml。

6.根据权利要求1所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(5)中，在4℃下，300g密度梯度离心20min。

7.根据权利要求1所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(7)中，在37℃、5％CO₂、相对湿度95％的环境中培养60h后换SAGM完全培养基。

8.根据权利要求1-7任一项所述的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞筛为100目。