[发明专利]一种具有穿膜功能的hMnSOD-R9及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学与生物化学领域，涉及一种具有穿膜功能的hMnSOD-R9及其制备方法与应用。

背景技术

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是生物在进化过程中形成的广泛存在于生物体内的有效清除活性氧的主要金属酶类之一，它在抗氧化防御中发挥最重要的作用。SOD能够平衡机体的氧自由基，从而避免当机体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，受到国内外学者和研究者的广泛关注，研究领域已涉及到化学、生物学、医学、食品科学和畜牧兽医学等多个学科。

SOD根据其辅基部位结合的不同金属离子分为4类：锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD），铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）,铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）和镍超氧化物歧化酶（Ni-SOD）。MnSOD主要存在于线粒体的基质中。线粒体是细胞的能量工厂，其氧化呼吸链的电子传递过程中是机体内自由基产生的最主要途径，所以Mn-SOD是清除O2-的第一道防线。MnSOD基因的表达和调控对机体内自由基-自由基清除剂的平衡体系至关重要（Holley AK,Dhar SK,Xu Y，St Clair DK.Manganese superoxide dismutase:beyond life and death.Amino Acids2012,42:139-158.）。由于Mn-SOD的重要作用，作为药物酶制剂，具有医用价值及临床应用前景，其在疾病的基因治疗上有很多报道，如在乳腺癌，口腔癌等方面的应用（Chuang TC,Liu JY，et al.Human manganese superoxide dismutasesuppresses HER2/neu-mediated breast cancer malignancy.FEBS Lett2007,581:4443-4449；Epperly MW，Wegner R,et al.Effects of MnSOD-plasmidliposome gene therapy on antioxidant levels in irradiated murine oral cavityorthotopic tumors.Radiat Res 2007,167:289-297.）。

Mn-SOD的来源主要有以下几种：一是直接从动物和植物体提取，来源丰富，但是提取和纯化工艺较复杂。二是利用生物工程基因重组生产，此法生产的SOD重组蛋白由于具有来源稳定、产量高、周期短、工艺简单、可规模化生产、易纯化等优点，得到越来越多的关注。

迄今发现的MnSOD大约有30多种，已完成氨基酸序列全分析的MnSOD有近10种。其中通过分子克隆表达的MnSOD种类的有线虫、弓浆虫、橡胶树、萝卜、桃子、虾和人等。来源于其他物种的MnSOD对于人体来说具有更大的免疫原性。活性氧主要存在于细胞内，因此开发能透过细胞膜清除细胞内活性氧的SOD具有重要的意义。目前研究已表达的MnSOD都不含有蛋白转导域（Protein transduction domain,PTD），不能通过细胞膜，因此只能在细胞外起作用，大大限制了其活性的发挥。

以往采用显微注射法，电穿孔法，脂质体法，病毒载体等方法将生物大分子导入细胞内，对细胞毒性大且效率低。而蛋白转导域（PTD）是一类能携带其他生物大分子（蛋白质，多肽等）穿过多种哺乳动物细胞膜的短肽。常用的高效蛋白质转导结构域有黑腹果蝇触足肽（Antenapedia,Antp43-58），HIV-1反式激活蛋白（Transactivating protein,TAT47-57），单纯疱疹病毒转录调节蛋白（VP22）和精氨酸富含肽（Arginine-rich peptides）等。精氨酸富含肽蛋白转导域具有转膜速度快，转运效率高的特点，这位将外源性蛋白导入细胞提供了理想手段。

研究发现，多聚精氨酸（Polyarginine）型蛋白转导域是含有九个精氨酸组成的跨膜肽（简称R9），由于其带有高强度的正电荷，因此能够迅速与细胞膜结合，通过内吞等方式实现跨膜转运，有很高的跨膜转运效率，并且对细胞本身没有损伤，其穿膜作用不受细胞类型的限制（Fuchs SM,Raines RT.Polyarginine asa multifunctional fusion tag.Protein Sci 2005,14:1538-1544.）。