[发明专利]草莓防褐变专用初代培养基及其生产组培草莓苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种防止草莓组织培养过程中褐变的培养基及利用其组培繁育草莓苗的方法。

技术背景

草莓是蔷薇科草莓属多年生草本植物，是世界七大水果之一，营养丰富，有“水果皇后”的美称。另外食用草莓对肠胃病和贫血病有一定的疗效，对促进智力发育有重要作用。深受国内外消费者的喜爱。

草莓是一种栽培周期短、结果早、见效快的经济作物，但是草莓的病毒害严重影响草莓的生产。作为高级浆果的草莓，在我国目前的生产栽培上多沿用无性繁殖种苗：主要方法是匍匐茎繁殖和分株繁殖，但这两种方法效率低、种苗易退化、易造成病毒蔓延。王国平（1988）等调查，我国栽培草莓带病毒植株率过80%以上，戴子林（1995）等调查，我国长江流域感染大面积植株感染率在50%以上，感染了病毒病的草莓结果会存在变小、畸形、品质差、生长缓慢等问题，一般减产30%-80%，并逐年加重；严重影响草莓的长势、品质和产量，对病毒病目前还没有药剂可以防治。

目前，解决草莓病毒病的主要方法是通过草莓脱毒组培技术来扩繁草莓脱毒苗，使草莓种苗回复品种的优良性状以达到优质、高产的目的。目前，常见草莓外植体组织培养类型包括：草莓茎尖组织培养、草莓叶片和叶柄组织培养、草莓茎段组织培养、草莓花药培养。草莓组织培养程序一般可分为外植体准备、苗诱导、增殖培养、生根培养、移植驯化等几个阶段，其中在每个阶段的培养基选用、温室条件等对组培苗的繁育系数、脱毒效果、再生率等关键参数有着重要影响。其中MS培养基是草莓组培过程中最常用的培养基，即Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的具备较高无机盐和离子浓度的稳定培养基，其硝酸盐含量高、养分的数量和比例合适，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长，是目前被广泛应用于植物组织培养快速繁殖的基本培养基。

但是，在草莓组织培养中，褐变是影响初代培养褐化和限制初代培养再生率的重要原因，即外植体或培养材料接种后在组织培养过程中，由于切割造成机械损伤，伤口处分泌出酚类化合物，在有氧的条件下，切面细胞中的酚类物质为多酚氧化酶催化，氧化为醌，醌再通过非酶促反应产生有色物质而导致组织褐变，变成棕褐色或暗褐色，并逐渐扩散到培养基中，抑制细胞内其它酶的活性，影响细胞的正常代谢，毒害整个组织，甚至导致组织死亡。

中国发明专利（申请号201010252871.4）公开了一套草莓茎尖组培专用的初代培养基、继代培养基和生根培养基以及用该系列培养基培养草莓茎尖组织生产脱毒苗的方法。其所述的初代培养基是以MS培养基为基本培养基，并在其中添加浓度为0.2-0.5 mg/L的6-苄氨基嘌呤（BA）和0.1-0.2 mg/L的萘乙酸（NAA），并在初代培养时进行暗培养预防褐化，但其防止褐变的主要手段还是在于减少光照以抑制PPO的活性，防止多酚类物质的氧化，从而减少被培养的组织褐变。但这种技术手段下初代培养的成活率仅从普通的40%左右提升到50-65%，还有提升的空间。

王栋等在《植物组织培养中的褐化现象及其防止措施》（黑龙江农业科学2008(1)：7～1O）中分析了植物组织培养过程中出现褐变的若干因素，并公开了利用吸附剂（有聚乙烯吡咯烷酮、活性炭等）和抗氧化剂（抗坏血酸、硫代硫酸钠、柠檬酸、L一半胱氨酸、谷胱甘肽、芸香苷、二硫苏糖醇、酪氨酸、巯基乙醇、卵清蛋白、维生素B、维生素E、有机酸、蛋白质水解产物、氨基酸、亚硫氢酸钠、氰化钾、多胺）等用来减少植物组织培养中的褐变现象。其主要原理在于通过吸附组织培养过程中由于切割造成机械损伤处分泌的酚类化合物，或者通过上述抗氧化剂防止扩散到培养基中的酚类化合物被氧化成褐色的醌类物质，从而达到防止褐变的作用。但是，这种方法的不足之处在于只能被动解决扩散到培养基质中的酚类化合物，在实际生产过程中还是会存在较高的褐变现象。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种相对于现有防褐变技术能更有效预防草莓组织培养过程中发生褐变的专用初代培养基。

本发明的另一目的在于：提供一种再生率高的组培草莓苗生产方法。

本发明的技术方案是：一种能有效预防草莓组织培养过程中发生褐变的专用初代培养基，以0.2-0.5 mg/L的6-苄氨基嘌呤（BA）和0.1-0.2 mg/L的萘乙酸（NAA）的MS培养基为基本培养基，并在其中添加浓度为5-15 mg/L的抗坏血酸（VC）和0.001-0.5 mg/L的油菜素内酯（BR），其中pH值保持在5.7-5.8；