[发明专利]布鲁氏菌脂多糖共同抗原单克隆抗体的制备及c-ELISA方法的建立

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域。具体地，本发明涉及一种针对布鲁氏菌(Brucella)脂多糖共同抗原的单克隆抗体，以及基于该单克隆抗体的c-ELISA方法、包含该单克隆抗体的试剂盒和诊断检测试剂。

背景技术

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引发的人畜共患传染病。导致流产、不育和关节炎等症状。人感染布鲁氏菌产生更为严重的症状，呈波浪热，关节和肌肉疼痛难忍，丧失劳动能力，同时还会影响生育，严重者可导致死亡。它流行于160多个国家和地区，我国布病疫情在20世纪80年代末至90年代初曾得到较好控制，从1993年后我国布病疫情呈逐年上升趋势。世界每年因此病都造成巨大的经济损失。

感染布鲁氏菌后产生的血清学反应直接针对于表面的光滑型脂多糖(sLPS)。所以，在人类及动物的布氏杆菌病的诊断中，主要依据对抗S-LPS抗体的检测。传统上的程序，根据血清学上的诊断来决定屠杀感染的动物，但是，世界动物卫生组织(OIE)以及我们国家的标准诊断方法中虎红凝集(RBPT)、试管凝集(SAT)和补体结合实验(CFT)等都存在问题，如不适合大量的临床样品检测、有假阳性和敏感性不足的问题。

S型布鲁氏菌目前发现有四种类型表位：A或者M表位；S型布鲁氏菌特有的C表位；S型布鲁氏菌与小肠结肠炎耶尔森氏菌O：9共有的C/Y表位。C表位的化学结构目前仍没有被明确的鉴定。

发明内容

为了解决畜牧业生产中牛羊布病检测、筛查和检疫净化的生产实际需要，同时尽量排除其他有交叉反应细菌的非特异性干扰，本发明人建立了以单克隆抗体14F4为竞争抗体的竞争ELISA检测方法。该方法适用于大规模临床样品的检测，具有快速、高通量、高敏感性及高特异性的特点，有效地克服了布鲁氏病检测国标的不足。

本研究将3个不同种布鲁氏菌的sLPS进行了提取、纯化和鉴定，并研制了针对S型布鲁氏菌O链C抗原表位的特异性单克隆抗体，建立了cELISA诊断方法，为布病检测、筛查和检疫净化的生产实际需要，提供了新的检测手段，使布病的检测结果更加准确可靠。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.针对光滑型布鲁氏菌(Brucella)脂多糖(sLPS)的单克隆抗体。

2.根据以上1所述的单克隆抗体，其中所述布鲁氏菌是布鲁氏菌疫苗株M5-90。

3.根据以上1或2所述的单克隆抗体，其针对S型布鲁氏菌特有的C表位，优选所述单克隆抗体的重链亚型为IgG3，轻链均为κ链。

4.根据以上1-3中任一项所述的单克隆抗体，其由小鼠杂交瘤细胞系14F4(CGMCC No.6036)产生。

5.产生根据以上1-4中任一项所述的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系，优选保藏号为CGMCC No.6036的小鼠杂交瘤细胞系14F4。

6.一种用于诊断布鲁氏病的诊断试剂或试剂盒，其包含根据以上1-4中任一项所述的单克隆抗体。

7.根据以上6所述的诊断试剂或试剂盒，其用于通过竞争ELISA(cELISA)方法来检测样品中的布鲁氏菌抗体，优选所述样品是来源于受试者血清。

8.根据以上6或7所述的诊断试剂或试剂盒，其中将sLPS作为抗原包被酶标板，洗涤后用封闭液封闭酶标板，将根据以上1-4中任一项所述的单克隆抗体和待测血清与包被抗原孵育，之后洗涤酶标板，加入抗鼠的酶标二抗，并且通过二抗相应检测方法(如底物显色法，例如TMB作为底物)判定结果。

9.根据以上8所述的诊断试剂或试剂盒，其中所述酶标二抗是HRP标记的山羊抗鼠IgG或绵羊抗鼠IgG。

10.根据以上1-4中任一项所述的单克隆抗体、根据以上5所述的杂交瘤细胞系或根据以上6-9中任一项所述的诊断试剂或试剂盒在制备体外检测布鲁氏菌或抗布鲁氏菌抗体的试剂中的应用，优选所述检测是通过竞争ELISA(cELISA)方法来进行的。

在本发明的一个优选实施方案中，采用常规的单抗制备方法，将布鲁氏菌疫苗株M5-90免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术获得杂交瘤细胞。以M5-90、S-19和S2的sLPS作为抗原包被酶标板，对杂交瘤细胞进行筛选，获得1株稳定分泌特异性单克隆抗体的细胞株，命名为14F4。亚型分析表明，14F4轻链亚类均为κ，重链为IgG3。效价实验表明单抗14F4效价1：5.4×10⁵；交叉反应试验表明，单抗14F4与大肠杆菌(O：157)、都柏林沙门氏菌(C79-86)全菌体及LPS无交叉反应。