[发明专利]一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT

说明书

技术领域

本发明公开一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT，属于生物技术领域。

背景技术

β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23），通常称为乳糖酶，可催化牛奶和奶制品中乳糖水解产生葡萄糖及半乳糖，并且具有半乳糖苷转移作用。乳糖酶在食品、医药、能源工业和畜牧业等领域的广泛应用，因而受到越来越多的关注。通过牛奶和奶制品中乳糖的水解增加这些食品的营养价值，解决乳糖不耐症食用牛奶和奶制品出现的问题，同时产乳糖酶的微生物可以用于处理乳清废水，减少环境污染。许多细菌、丝状真菌和酵母菌可以产生乳糖酶，其中克鲁氏酵母菌如马克斯克鲁氏酵母（Kluyveromyces marxianus），乳酸克鲁氏酵母（Kluyveromyces lactis）和极地耐冷酵母菌Guehomyces pullulans 17-1菌株产生的乳糖酶受到广泛重视。尤其马克斯克鲁氏酵母具有很强的同化乳糖和菊粉的能力、生长速率极快、代时短、生长时耐高温、具有很强的分泌胞外产物的能力和是被美国食品药物局确认为最安全的微生物，而在许多方面得到了广泛应用。但是所有产乳糖酶的微生物乳糖酶基因表达和合成乳糖酶时会受到培养基中的葡萄糖严重阻遏，由于工业用培养基和含乳糖培养基中存在有葡萄糖，所以葡萄糖阻遏会严重影响有关微生物的乳糖酶产量。

在葡萄糖阻遏过程中一种叫做Mig1蛋白起非常重要的作用，这种蛋白是一种带有C2H2的锌指蛋白，能结合在受葡萄糖阻遏的各种基因启动子上，被结合的基因启动子必须含有(G/C)(C/T)GGGG序列，在该序列的5‘-端还得有富含 AT的区域（AT-rich region）。现在发现Mig1蛋白是细胞中具有广泛调控作用的一种蛋白质，只要这些蛋白基因启动子含有(G/C)(C/T)GGGG序列，这些蛋白基因的表达都会受到Mig1蛋白的调控作用。所以该细胞中MIG1基因被敲除后，许多蛋白基因的表达都会受到葡萄糖解阻遏作用，在有葡萄糖存在情况下有关蛋白质或酶产量会大幅度提高。这样构建合适的敲除载体，敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因，对于提高该酵母菌的乳糖酶具有非常重要的生产实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT，可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因，用于敲除该酵母MIG1基因，获得乳糖酶基因表达葡萄糖解阻遏菌株。

本发明的技术解决方案如下：构建了可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因的敲除载体pMD19-HPT,携带有潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）、用于同源重组的马克斯克鲁氏酵母MIG1基因启动子序列和终止子序列和用于删除HPT基因的Loxp片段（5'-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT- 3'），在HPT基因表达框上下游各加入一个LoxP位点，并使二者同向，可以利用Cre重组酶将HPT基因表达框删除。在转化敲除载体进入产乳糖酶的马克斯克鲁氏酵母细胞之前，用DNA限制性内切酶XhoI酶切质粒pMD19-HPT，获得MIG1基因启动子片段-HPT基因-MIG1基因终止子片段；转化该片段到产乳糖酶的马克斯克鲁氏酵母细胞后，通过同源重组插入到正常的MIG1基因中，利用HPT基因取代MIG1基因ORF框，并可以稳定遗传；获得转化子之后，把质粒pKlNatCre（携带有酶切Loxp片段的酶基因）转化到转化子中，表达后删除HPT基因，获得无HPT基因和MIG1基因的敲除菌株。

本发明公开的一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT，其碱基序列见如SEQ No.1所示。该载体大小为4137 bp。

本发明提供的一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT制备方法如下：

（1）PCR产物的扩增