[发明专利]一种以环糊精辅助植物甾醇组合物制备雄甾4-烯-3，17-双酮的方法

说明书

发明领域

本发明一般地涉及制备雄甾-4-烯-3，17-双酮的方法，该种方法通过加入少量环糊精有效地提高了以植物甾醇组合物为底物制备雄甾-4-烯-3，17-双酮的收率，同时缩短了发酵时间，非常有利于工业化。

背景技术：

雄甾4-烯-3，17-双酮(androst-4-ene-3，17-dione，简称：雄烯二酮或AD)是甾体激素类药物不可替代的中间体，对机体起着非常重要的调节作用。可以说几乎所有甾体激素药物都是以AD作为起始原料进行生产的。如用于生产性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮质激素，又可用于合成氢化可的松，氧化泼尼松，黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也是直接用于生产抗早孕药米非司酮和各类计划生育用药的必不可少的基本原料。如今AD不断被一些发达国家用于开发和生产新的医药主品，如福美司坦(Formestane或Lentaron)，等及类固醇类激素免疫抗原等，目前全世界范围内，AD的应用领域日益拓宽，用AD做原材料生产的医药品种不断增加。

由于化学全合成雄烯二酮成本较高，国内外很多科学家一直研究如何通过生物发酵方法得到雄烯二酮。50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有双链的大豆甾醇和麦角甾醇为原料生产出雄甾-4-烯-3，17二酮(AD)及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)并以此作为合成甾体药物的原料。近年来，由于甾体药物应用量逐年增加，人们的目光又转到在动植物界中含量较多的胆甾醇，谷甾醇，菜油甾醇等，并被认为是具有巨大潜能的甾体激素类药物的起始原料。20世纪60年代中期，由Sih等首先发现有些微生物可以选择性降解切除甾醇的饱和侧链而得到AD和ADD，70年代初，日本的有马启利用微生物降解胆甾醇生产ADD获得成功，受到许多制药公司的高度重视。为了大量生产类固醇激素，研究者试图使用甾醇为唯一碳源分离微生物和改变甾醇结构用作发酵的底物，并用能防止甾醇核降解的化学添加剂来提高类固醇的收得率，这一努力己获得很大进展(Marsheck等，Aplied Microobiology，23(1)：72～77，1972)。此外，埃及国家研究中心生物与天然产品化学系的和Sallam等研究发现，利用磷酸盐缓冲液调节底物培养基pH值5.5～7.38可提高生物降解AD、ADD的转化率。Upjohn公司在美国专利No．4，293，644中描述了一种通过分枝杆菌(ATCC 29472)的突变株从多种类固醇中得到以高产量的雄-4-烯-3，17-二酮(AD)为主，并有少量雄-1，4-二烯-3，l7-二酮(ADD)的产物的方法。以后的研究发现节杆菌，诺卡氏菌和分枝杆菌等微生物均可用于直接切除甾醇的饱和侧链，在一定条件下得到AD和ADD，这使得微生物转化工业化生产成为可能。

由于生物发酵方法研究较多的是菌种，但发酵效果除了与菌种本身密切相关外，菌种在发酵过程中所使用的方法也十分重要。杨英在文章中指出（微生物降解甾醇侧链转化雄甾-4-烯-3??17-二酮的研究进展，微生物学通报，2006年33 ( 6)，142-145）甾醇底物在水溶液培养基中溶解度差和存在严重的产物(底物) 抑制的问题一直困扰了整个甾类工业，甾醇是一种疏水性化合物, 在水中溶解度极低, 这就导致底物与微生物细胞不能很好的接触, 使转化率偏低及转化时间延长。采用超声破碎、表面活性剂及有机溶剂来溶解底物虽然取得了一定成果, 但表面活性剂和有机溶剂对细胞的活性有一定的抑制从而制约了它的应用。

分支杆菌(Mycobacterium sp．)是一种可以使植物甾醇发酵而得到雄甾-4-烯-3，17二酮(AD)及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的重要菌种，其发酵过程也存在上述问题。

同时利用分支杆菌进行发酵，时间较长，往往长达72小时，多篇文献对此均进行了可介绍，例如CN03804973，而长时间发酵的问题在于首先是容易造成微生物过分发酵，将得到的AD/ADD转化为9α-羟基睾酮甚至将甾环降解，其次是反应时间过长会使杂菌增加，而培养菌的转化专一性下降，从而增加杂质，第三长时间反应还会造成生产周期、制造成本、人工成本等上升，不利于工业化。