[发明专利]嗜热长链烷醇醇脱氢酶及其晶体结构

说明书

技术领域：

本发明涉及到用X射线晶体衍射方法确定的一种嗜热长链烷醇醇脱氢酶晶体结构，属于分子生物学和应用微生物学领域。

背景技术：

醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase,ADHs,EC 1.1.1.1）是生物体内重要的氧化还原剂之一，很多醇类代谢都是通过醇脱氢酶催化完成的。在动物、植物、微生物、真核生物以及原核细菌中都已发现醇脱氢酶，至少有25个EC编号的酶被称为醇脱氢酶。

醇脱氢酶能够催化醇类物质到醛类物质的可逆氧化。ADHs的底物范围很广，其所起到的生理学作用也是多种多样的。在微生物烷烃类物质的末端降解途径中，ADHs催化反应中的第二步，末端降解途径如图3所示。

在正烷烃类物质末端降解途径中，由烷烃加氧酶将烷烃氧化为长链烷醇，再由醇脱氢酶进一步脱氢为长链烷醛，生成的长链烷醛在醛脱氢酶的作用下脱氢生成长链脂肪酸。在长链脂肪酸辅酶A连接酶作用下生成长链烷酸辅酶A后进入三羧酸循环，最终完全氧化为二氧化碳和水。

醇脱氢酶来源广泛，种类繁多。依赖NAD(P)H的醇脱氢酶，根据它们的分子性质和金属含量，能够分为三类。I型：Zn²⁺依赖的长链醇脱氢酶（每个亚基含有约350个氨基酸残基），如来自于大肠杆菌Escherichia coli的菌株K-12中的YqhD。II型：不含有金属的短链醇脱氢酶（每个亚基中含有约250个氨基酸残基），如来自于栖热菌属的Thermusthermophilus HB27中的醇脱氢酶即属于该型脱氢酶。III型：含铁的/由铁激活的长链醇脱氢酶（每个亚基中含有385-900个氨基酸残基），如来自于发酵单胞菌属的Zymomonasmobilis ZM4中的醇脱氢酶，该醇脱氢酶需要铁离子存在才能活化发挥功能，以及来自于大肠杆菌E.coli的菌株ECL1中的含铁的醇脱氢酶。

不动杆菌属中菌株HO1N对于十六烷醇具有降解活性。从一些已知的烷烃降解细菌，如假单胞菌属Pseudomonas fluorescens NRRL B-1244、假单胞菌属Pseudomonas butanovoraATCC 43655、不动杆菌属Acinetobacter M-1，以及一些尚未了解具有降解烃类物质功能的细菌，如土壤芽孢杆菌属Geobacillus stearothermophilus LLD-R、热球菌属Pyrococcusfuriosus DSM 3638，以及黄杆菌属Flavobacterium frigidimaris KUC-1，等菌株都表现出了对于短链长到中等链长（C2-C14）烷基醇的降解活性。然而，具有降解较长链长（C15及以上）烷基醇的醇脱氢酶到目前还没有报道。目前研究最为清楚的是酵母菌中的醇脱氢酶，其为四聚体，单个亚基肽链含有347个氨基酸残基，亚基分子量为35000。酵母醇脱氢酶对底物专一性强，对乙醇及其他直链伯醇活性较高，只对少数仲醇和侧链烷醇具有活性。

在石油烃降解途径中，嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2中的长链烷醇醇脱氢酶是十分重要的关键酶，其能够耐高温并高效利用烷烃单加氧酶的催化产物长链烷醇，使其进一步脱氢，提高烷烃降解途径中的催化效率；另一方面，它有着比长链烷烃单加氧酶更广泛的底物范围，不仅能够催化长链烷醇，还对短链醇有很高的催化能力。因此，对长链烷醇醇脱氢酶的研究不仅有利于深入了解嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2降解长链烷烃途径的机制，为探索其它烷烃降解菌的代谢途径提供理论基础，对该酶构建高效表达工程菌株及大量纯化更具有广阔的工业应用前景和经济价值。

经文献检索，未发现与本发明的嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构相同的公开文献报道。

发明内容：

本发明目的是为了更加深入了解嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2中参与正烷烃末端降解途径中的嗜热长链烷醇醇脱氢酶的结构与功能之间的关系，提供嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构；本发明通过蛋白质表达、纯化和悬滴气相扩散结晶方法获得了该嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体，并通过X射线衍射方法对醇脱氢酶的晶体结构进行了解析。