[发明专利]一种诱导间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法

说明书

本发明涉及一种诱导间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，具体而言，是一种使用具有半通透型支架隔离系统的培养小室，定向诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的方法。

背景技术

近年来研究表明，成熟细胞在体外扩增困难，并且会很快老化进而失去增殖能力。干细胞具有自我复制的能力以及向一种或多种成熟细胞分化的特征。因此体外培养干细胞可以作为组织工程学等生物研究种子细胞的新来源。干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以分化成各种类型的细胞，但存在伦理问题和瘤化风险，因此应用受到了限制。成体干细胞取材方便、来源广泛，也可以分化成多种类型的细胞，且培养诱导容易，因此更加适合作为临床应用的种子细胞。间充质干细胞作为成体干细胞的一种，因为其分离培养技术最为成熟，目前应用最为广泛。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

目前，实现MSCs细胞的诱导分化主要包括：采用化学因子诱导、添加特定的细胞因子、转入特定基因等方法。这些方法存在比较明显的缺陷，添加的化学因子，对细胞有一定的毒副作用，使细胞生长减缓，细胞内部产生一系列不易被检测到的变化：细胞因子成本较高，只是几种细胞因子的组合，并不一定是最适的组合，同时由于细胞因子添加的比例不合适可能会引发众多的不相关生化反应；转基因技术本身成本过高，同时，会在细胞内引入多余的基因，改造过的细胞的安全性得不到保障。还有人使用如成骨细胞和MSCs直接共培养的方法来诱导分化，这种方法难于实现大规模诱导，诱导用细胞一次性消耗，需要不断培养用于诱导的成骨细胞，同时诱导出的细胞是混杂的细胞，没办法得到纯化的诱导细胞。

对于细胞和细胞间的相互作用以及共培养诱导细胞定向分化的研究技术，本领域有很多相关的报道，例如，Transwell技术即是现有的较为常见的细胞共培养定向诱导技术，Transwell技术的核心是利用一类有通透性的杯状的装置，例如膜滤器(Membrane filters)、通透性的支架(permeable supports)等，研究不同细胞之间的相互作用，以及定向诱导的情况，该技术广泛的应用在如趋化性实验、肿瘤细胞的迁徙、侵润的实验等具体的工作中。

但是，将这种这一技术应用于间充质干细胞的定向诱导或定向分化中，目前尚未见有系统性的研究工作。利用小室技术来诱导MSC细胞定向分化，需要确定以下问题：在基础培养基中是否要添加细胞因子、激素、小分子化合物或特殊成分；还要确定最佳的诱导比例，即目标细胞与MSC细胞的比例；诱导时间的长短。

本发明使用成骨细胞作为底层细胞，MSCs作为内层细胞，利用Transwell小室进行共培养，最大限度上的减少培养基中特异添加物，只需要共培养8-10天就可得到生长旺盛的诱导细胞。

发明内容

具体而言，本发明涉及一种通过transwell技术对间充质干细胞的进行定向诱导，促使其向成骨细胞分化的方法。

本发明所述的培养MSC细胞并将其诱导为成骨细胞的方法中，所述的MSC细胞和诱导用成骨细胞可以是自体来源，也可以是异体来源。

具体而言，本发明所述的培养MSC细胞并将其诱导为成骨细胞的方法为：

步骤1、MSC细胞的获取与稳定培养。

无菌条件下，采健康人红骨髓，等体积加入含肝素钠(0.1～1.5mg/ml)的生理盐水，充分混匀，轻轻加入到密度为1.077g/mL的Ficol溶液上(Sigma，USA)，1500～2500r/min，离心20～40min，收集离心管中部云雾状的单个核层细胞层，用PBS(pH7.2～7.4)洗两遍。

按照0.5～2x10⁶cells/瓶，接种上述步骤中获得的细胞到75cm²培养瓶中，DMEM(含10％胎牛血清FCS)，37℃5％CO₂，培养。培养传代至P3代，流式检测、鉴定MSC纯度。

步骤2、成骨细胞的获取与培养