[发明专利]高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程细胞株。

背景技术

芋螺(Conus)多数生活在热带海洋的浅水区，种类繁多，目前发现的芋螺有500多种，根据其不同种的外形、花纹及色泽等进行命名和分类。捕食时，它们会向猎物投射接连毒腺管和毒囊的针状齿舌，并注射毒液，猎物一旦被击中，就立刻麻痹，成为芋螺的食物，这种毒液的主要成分便是芋螺毒素(conotoxin，CTx)。

芋螺毒素(conotoxin，CTx)是一类来源于芋螺毒液的活性多肽。芋螺毒素通常是由10~46个氨基酸残基组成，分子量小，结构多样，富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架，主要作用于钠、钾、钙等多种离子通道和神经递质受体，阻断或增强神经兴奋信号的传递，是迄今发现分子量最小的一类多肽毒素。芋螺毒素具双重效应，一方面阻断痛觉传递而具镇痛效应，另一方面抑制兴奋毒性(excitotxic）神经递质释放，阻止神经元细胞病理性钙内流而有神经保护作用。因其直接作用于钙通道，无需第二信使或G蛋白，故不成瘾，将成为慢性重症疼痛如晚期恶性肿瘤和AIDS病，取代用阿片类成瘾的神经性疾病的新一代药物。

芋螺毒素因生物活性强，作用靶点广且具有高度选择性，可直接作用药物，又可以作为设计新药的先导化合物，具有重要的理论研究价值和应用价值。但是从芋螺体内获得芋螺毒素的数量远远不能满足市场的需要，因此利用生物转基因技术获得表达芋螺毒素的工程菌株成为发展的的趋势。

但是目前所知的转基因工程菌株都存在芋螺毒素分泌表达量低的缺陷，而且有研究表明ω-芋螺毒素中只有天然二硫键的形成才能促使进一步正确的折叠。因此，如何保证转基因后芋螺毒素的二级结构，保持其生物活性，成为困扰芋螺毒素转基因设计的一大难题。现有的芋螺毒素重组菌（或转基因菌株）都采用在发酵上清液中加入β-巯基乙醇将二硫键打开，然后再透析过夜使其在空气中缓慢氧化，最终形成正确的二硫键配对形式。但这种方式不适用于工业化大规模生产，且成本高，生产周期长，也许存在一定的风险。

发明内容

本发明要解决现有转基因工程菌株芋螺毒素分泌表达量低，且需要在发酵上清液中加入β-巯基乙醇再透析过夜，导致成本高，生产周期长，风险增加，不适合工业化大规模生产的问题，而提供的一株高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。

本发明高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株按以下步骤制备：

一、设计芋螺毒素转基因序列，基因序列如SEQ ID NO：1所示； 

二、合成芋螺毒素转基因DNA片段，然后导入T载体中；

三、目的片段双酶切，用BamHI及EcoRⅠ双酶切消化T载体，反应体系为

酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段CTx；

四、质粒载体双酶切：用BamHI和EcoRⅠ双酶切消化质粒载体pcDNA3.1/V5-His-C，反应体系为

酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用0.6%琼脂糖凝胶电泳，再用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的载体pcDNA3.1/V5-His-C；

五、插入片段CTx与经过双酶切的载体pcDNA3.1/V5-His-C连接，连接反应体系为

连接反应条件为16℃放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-CTx； 

六、重组质粒转染CHO：将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-CTx与质粒pDCH1P11混合，使用Lipofeetmine^TM 2000 Reagent共转染CHO-dhfr^-细胞，在24孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFMⅡ，500μL/孔，转染6h后更换含100mL/L FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFMⅡ，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1:10传代，24h细胞贴壁后更换为不含HT和NAA、含G418  0.75mg/L和FBS 100mL/L的选择性培养基，培养14～16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经 ELISA试剂盒测定对阳性高表达的细胞克隆进行扩大培养；