[发明专利]一种polyoxinK高产菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多氧霉素有效组分polyoxinK高产菌株的构建方法，属于生物制药领域。 

背景技术

近年来，生物学技术的发展为农业生产提供了更加广阔的前景；同时农业生产的快速发展，对相应的抗生素的需求量增加。目前需要高产高效药物来应对日益增加的市场需求。 

作为几丁质合成酶的特异性抑制剂，多氧霉素不仅具有广谱的抗真菌活性，并且对动植物毒性较低。多氧霉素属于多组分抗生素。附图5所示是多氧霉素多种组分的结构。 

在所有的组分中，polyoxinA与polyoxinH为主要组分，但生物活性最高的组分却是polyoxinB（烟草赤星病，苹果斑点落叶病），polyoxinD（水稻纹枯病），polyoxinK（稻瘟病）以及polyoxinL（烟草赤星病，苹果斑点落叶病），但是四者却是少量组分，所以这是一对矛盾。在传统的育种实践中，通过诱变提高多氧霉素整体效价的同时，生物活性较弱的组分效价也相应的提高，但是随着多氧霉素生物合成基因簇的成功克隆以及生物合成深入阐明为实现多氧霉素组分的优化与途径改造提供了坚实的基础。 

本发明通过基因工程的手段对多氧霉素工业菌株特定的功能基因进行敲出，从而来特定的积累具有较高生物活性的组分。 

发明内容

本发明所解决的问题是提供一种多氧霉素有效组分polyoxinK的高产菌株的构建方法。 

本发明利用基因工程的策略对多氧霉素工业菌株的特定基因进行敲出而定向的积累特定的有效组分。 

polyoxinK，其结构式如下所示： 

构建上述高产菌株的方法包括以下步骤： 

1）工业菌株的polB突变株CXR1的构建及筛选 

将polB的中断载体pJTU4720,通过转化导入ET12567/Puz8002的感受态中；挑取单菌落接入指形瓶中8-10h后按照1：10的比例转接到LB内37℃摇3小时；进行通过接合转移的方式转到金产色链霉菌工业菌株中，接合子经过抗性验证及PCR复证正确后，经放松培养，梯度稀释，在阿泊拉霉素和硫链丝菌素平板上验证，证明挑取的候选突变株为预期的polB中断突变株； 

2）突变株的发酵 

调节发酵液pH值至3.0，将突变株直接进行发酵。 

Polyoxin K组分与H组分及A组分的区别在于，前者核苷骨架上无C-5甲基化修饰，CXR1突变株发酵液与野生型相比对指示真菌表现得强抑制活性显示出光明的应用前景，相关的抑菌谱和药理学评价研究正在展开，工业化应用也在进行之中。本发明方法获得了Polyoxin K组分的高产菌株，为工业化应用提供了可靠的保证，不仅提升了产量，而且为其它抗生素的基础研究提供了典型范例。 

附图说明

图1突变株CXR1的构建示意图。 

图2突变株CXR1的生物学测定。 

图3CXR1突变株发酵液组分的液相色谱检测。 

图4突变株CXR1的LC-MS分析。 

图5是多氧霉素多种组分的结构。 

具体实施方式

本发明提供了一种构建高效的polyoxinK组分高产菌株的一种有效方法。现将具体方法介绍如下。 

1.工业菌株的polB突变株CXR1的构建及筛选 

在构建工业菌株的polB的突变株之前，先构建polB中断载体pJTU4720。中断载体pJTU4720转化到ET12567/PUZ8002的感受态内；挑取单克隆到5ml的LB内37℃培养8-12小时后按照1:10的比例转接到5ml的LB内37℃培养3小时；同时取多氧霉素的工业菌株金产色链霉菌的孢子1ml到EP管内12000rpm/3min去上层甘油，然后加入1ml的水弹匀后按照上述条件进行离心去上清，加入700微升的0.05M/L（pH8.0）的TES放入45℃的水浴锅内热激5分钟，之后加入750微升2x的孢子预萌发液30℃培养3小时；3小时后按照4000rpm/5min的条件收集大肠杆菌的菌体，收集的菌体用15ml的LB洗涤两次按照上述条件，同时多氧霉素工业菌株的孢子按照5000rpm/3min的条件进行离心，然后用1ml的LB按照上述条件洗涤两次；此时大肠杆菌与金产色链霉菌的菌体都处理并准备好，在大肠杆菌的菌体内加入1ml的LB,菌体混匀后加入金产色链霉菌的菌体内；混匀后铺于MS的平板上。