[发明专利]用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种检测特定核酸、蛋白质、病原体和细胞的多孔微量反应板。

背景技术

近年来，由于纳米颗粒的有序阵列排布技术飞速发展，银或金纳米岛的二维生物基底片的制备工艺迅速提高和成熟。基于这类基底片的表面增强拉曼散射光谱检测技术（SERS）以及表面增强荧光检测技术的灵敏度和稳定性也因此得到大幅度的提高，其理论检测下限已经达到单分子和单细胞的检测水平，因此极大地刺激了它们在医学检测和诊断领域的应用性研究。与目前使用的DNA、蛋白质和细胞检测技术相结合后，这些物理学方法将有望成为高度特异、高度灵敏、多指标高通量、可定性和定量的新一代生物医学检测系统，从而替代或改进目前广泛使用的DNA、蛋白质和细胞检测方法，将对肿瘤、感染等多类疾病的临床早期诊断带来革命性影响。

与目前常用来检测DNA、蛋白质和细胞的聚合酶链反应、酶标记、荧光标记、化学发光标记、量子点标记以及放射标记等技术相比，基于二维银生物纳米基片的拉曼分子标记的SERS技术具有如下明显优势：(1)能将拉曼信号倍增10⁶-10¹⁴，从而达到单分子的检测灵敏度，如果检测人体体液或组织切片中稀有细胞的胞内或胞膜分子，则能达到单细胞的检测水平；(2)拉曼光谱的激发波远窄于荧光和化学光(<2nm)，因此在进行多种拉曼分子标记和多指标检测时光谱干扰现象大为减弱，从而使结果判断更加特异，使真正的多指标分析和高通量检测成为可能；(3)拉曼信号不会发生荧光特有的淬灭现象,；(4)有多种多样的可产生稳定拉曼光谱的拉曼标记分子可供选择，种类远多于荧光蛋白；(5)只需单波长激发光即可检测很多种拉曼标记分子的拉曼光谱；(6)拉曼光谱能很容易地与生物标本的自发背景荧光相区别。

基于这些优点，近几年来SERS在生物医学检测中的应用研究日益增多。在DNA和RNA检测方面，用DNA探针固相化银生物纳米基片，同时用拉曼分子标记金或银纳米颗粒进行三明治夹心检测靶向DNA片段是常用方法。Yunwei Cao用DNA探针固相玻片，Cy3标记寡核苷酸链，并用银液增染玻片，到达20fM的DNA检测下限。Ho Pui Ho利用银纳米岛基片和金纳米颗粒将DNA检测下限进一步降为0.4fM。Lan Sun报道了一种PCR-free的定量检测多种RNA目的片段的SERS三明治法，在肿瘤细胞裂解液中检测到2.3pM的多种目的mRNA片段。这一结果真正提示了SERS技术替代real-time PCR法定量检测核酸的潜力。在蛋白质检测方面，拉曼分子和蛋白探针（抗体）共标记金属纳米颗粒（如银核金壳、银核硅壳等）。目前已被报道的检测下限有高有低，在1-100fg/ml范围之内。在细胞检测方面，血液中的循环肿瘤细胞、抗原特异性T细胞以及干细胞等的频率都远低于0.1%，目前最先进的检测方式是荧光染色加流式细胞仪分析。然而，当稀有靶细胞的频率低于0.1%时，流式细胞分析就不够准确了，因此近年来人们开始探讨用SERS技术检测人体中的稀有细胞。MichaelY.Sha利用自制的SERS检测装置对外周全血中的循环肿瘤细胞建立了SERS一步检测法，检测下限达到10-50cells/ml全血，从而可以有效提高临床对肿瘤转移的早期诊断率。这一检测灵敏度提示了SERS技术在检测医学稀有细胞领域中的巨大应用潜力。

尽管应用前景很好，但是目前SERS技术在生物医学领域中的应用仍处于模型研究阶段，还未进入真实的临床应用领域，主要原因有：已商业化的纳米生物基片较少。在物理制作工艺上，缺乏具有高度灵敏性和高度均一性的高质量生物纳米基片，因此不少实验室正加紧致力于基片制作工艺的提升；在医学检测上，缺乏与生物医学领域专家的紧密合作，更缺乏与生物医学检测实验室的大批量标本处理相配套的SERS检测平台。

迄今为止，未见有将SERS检测所用的生物纳米基片与生物医学检测中常用的多孔微量反应板相结合的实验报道，也未见本实用新型发明方案的知识产权情况。

在拥有粗糙金属表面的金/银生物纳米基片上，利用拉曼活性分子标记技术和表面增强拉曼散射光谱技术对特定的生物分子和生物细胞进行痕量检测甚至单分子/单细胞检测是一种正处于探索和快速发展阶段的新一代生物检测技术，还未真正进入生物医学的广泛应用阶段，也缺乏与医学检测实验室的大批量标本处理相匹配的检测反应平台。

发明内容