[发明专利]一种检测邻苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测邻苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法，属于生物技术领域。

背景技术

近年来在许多国家和地区，塑化剂对食品、环境的污染引起了人们强烈的担忧。邻苯二甲酸二丁酯(DBP)属于苯二甲酸酯类化合物，被普遍应用于塑料制品、胶水、油漆、指甲油、洗发水和沐浴液等数百种产品中。邻苯二甲酸二丁酯是半挥发性化合物，不与终产品共价结合，在生产和生活中，被不断地释放到大气、土壤和水环境中。环境中的邻苯二甲酸二丁酯又通过呼吸、饮食、皮肤接触等三种途径进入人体。因此，人类正面临着越来越高的邻苯邻苯二甲酸二丁酯暴露风险。有研究报告指出：我国普通人群DBP日摄入量为12.2ug/kg bw，高于世界平均水平。

动物模型研究和流行病学调查发现邻苯二甲酸二丁酯可以引起雄性生殖发育的障碍。邻苯二甲酸酯还具有免疫毒性，能导致儿童产生哮喘、湿疹、鼻炎等持久性过敏症。此外，邻苯二甲酸二丁酯还能能导致糖尿病、肥胖症等。

因此，邻苯二甲酸二丁酯检测已成为食品安全、环境监测、毒理学研究等领域的重要工作。由于邻苯二甲酸二丁酯在水环境、生物体内的含量较低，常常在检测域以下，因此邻苯二甲酸二丁酯的含量分析是一件非常困难的工作。 

早期用含同位素¹⁴C的DBP饲喂实验动物，然后检测体内组织中的放射性水平来评价DBP的水平。但是由于DBP在生物体内降解快，所检测到的放射量只是DBP和降解代谢物的总体水平，并不能代表DBP在生物组织内的真正含量。

现在DBP的分析多采用气相色谱（GC）、HLPC、GC-质谱联用法等色谱分析技术，但这些技术需要进行样品前处理等，耗时多，并且有较高的仪器要求，色谱柱等耗材价格昂贵，此外，还需要操作人员有丰富的经验。

免疫分析由于选择性强、灵敏度高，一次可检测多种样品，因此把免疫分析技术应用于DBP检测具有简便、快速、成本低的优点。张明翠等用一种DBP的多克隆抗体，通过免疫组化法分析了水和包装的食品中DBP的含量。Yanaihara等运用酶联免疫分析法(ELISA)分析了邻苯二甲酸酯类物质的含量。但是，这两个研究都是基于多克隆抗体的免疫分析。多克隆抗体对抗原的专一选择性、灵敏度上都不及单克隆抗体。多克隆抗体受限于实验动物，不能无限制的获取。此外，由于从不同动物个体中获取的多克隆抗体的选择性、灵敏度、效价等都不同，因此用多克隆抗体建立同一标准的免疫分析方法就很困难。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供操作简便、灵敏度高的检测邻苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法。

本发明提供两种酶联免疫吸附法（ELISA）检测生物样品和非生物样品中邻苯二甲酸二丁酯（DBP）含量。一种是人工抗原包被竞争抑制ELISA法测定DBP的含量，一种是半抗原包被竞争抑制ELISA法测定DBP的含量。

本发明所提供的方法之一是：

利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP单克隆抗体，样品中DBP和包被抗原DBAP-BSA竞争结合DBP单克隆抗体，再通过酶联二抗的显色反应和抑制率计算，而得到DBP的含量。

上述方法具体包括如下步骤：

1) DBP单克隆抗体的制备；

2) 抗体效价的测定

将人工抗原DBAP-BSA于酶标板中包被、封闭，与不同稀释度的DBP单克隆抗体结合，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm出的吸光度，吸光度接近1.0处抗体稀释度为单克隆抗体的工作浓度；

3) 标准抑制曲线的建立

将人工抗原DBAP-BSA于酶标板中包被，封闭，不同浓度DBP标准溶液与包被抗原竞争结合DBP单克隆抗体，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm处的吸光度，以抑制率为纵坐标，DBP浓度为横坐标，建立抑制率标准曲线；

4) 测定样品抑制率，通过抑制标准曲线确定样品中DBP含量

将人工抗原DBAP-BSA于酶标板中包被，封闭，样品溶液与包被抗原竞争结合DBP单克隆抗体，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm处的吸光度，计算出抑制率，通过抑制率标准曲线确定样品中DBP含量。

上述方案中，所述DBP单克隆抗体制备过程如下：人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞并克隆化；小鼠腹水法大量制备单克隆抗体；再通过硫酸铵沉淀法纯化DBP单克隆抗体。