[发明专利]一种构建植物病原诱导型人工启动子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种构建人工启动子的方法，具体涉及一种构建植物病原诱导型人工启动子的方法，属于植物病原诱导型人工启动子构建技术领域。

背景技术

作物转基因抗病：

在农作物生产上，病害严重影响农作物性状，比如生长缓慢、发育畸形、产量降低等，并造成巨大的经济损失。传统育种可利用亲缘种的抗性基因或作物自身的抗性基因通过杂交选育具有抗性的新品种。但传统育种可利用的抗性基因较少，所需时间较长。通过喷施化学农药来防治病害又会造成环境污染。利用抗病基因工程方法可提高农作物抗病性，缩短抗病品种选育时间。

抗病基因高效表达可提高农作物的抗病力，但外源基因在植物体内过表达常导致其能量消耗过多，降低农作物产量。因此，利用转基因抗病必须解决如何控制基因表达、控制什么基因表达的关键问题。与天然病原诱导启动子的病原诱导因子单一及本底表达高等特点相比，人工构建的病原诱导型启动子可根据需要自由组合不同顺式作用元件，达到既提高植物的广谱抗病性，又改变启动子的强度和病原诱导因子的目的。

启动子相关研究：

启动子是调控基因转录的一段DNA，也是构建基因工程表达载体的重要元件。天然启动子在表达强度和特异性等方面存在一定的局限性，但采用人工构建的方法，有望得到诱导因子广、本底活性低、表达强度高、启动表达快等特点的启动子。

启动子应答诱导可通过以下因素调控：（1）环境因素(如光照、冷和热胁迫)；（2）生物和非生物胁迫(病原菌、创伤、昆虫、干旱和盐)；（3）激素(如乙烯、生长素、脱落酸和水杨酸)；（4）化学药品(如四环素、铜、雌二醇和地塞米松)。外界环境胁迫不同程度影响着植物生长发育过程及状态，甚至对植物产生致死作用。解决该问题，可以用逆境胁迫专一诱导的启动子，但目前鉴定的胁迫诱导启动子的诱导调控能力和抗逆的转录活性仍不能使植物有合适的抗逆性，因此可通过人工构建更加灵敏、准确、经济、高效的多诱导因子人工启动子，从而提高植物对多种逆境的抵抗能力。Rushton等利用GCC元件、JERE元件、W1-box、W2-box等元件人工组合成多种四聚体启动子。经多种形式的分析，发现不同人工启动子的诱导因子不同，其诱导表达能力及其本底表达水平差异明显。

目前，人工启动子已经成为指导基因定向表达的有力工具，并且进入了植物应答特异的生物或非生物因子的发展阶段。Zhu等利用重叠延伸PCR技术构建了两个嵌合启动子pCL和pLC，调控基因在马铃薯块茎组织中和冷诱导条件下的表达。GUS活性结果显示，受冷处理诱导，pCL启动子调控的GUS活性在块茎中升高了约63%。在叶片中，嵌合启动子pCL也具有较高的冷诱导活性，但20℃时无转录活性。与pCL启动子相比，20℃或2℃条件下，pLC启动子在马铃薯所有的组织中的活性都较低，但经过冷处理后，块茎和匍匐茎的GUS活性都有轻微的增加，并且块茎中的GUS活性显著增加约68%。现有报道两个人工启动子4 × ABRE(来自小麦的四个串联重复脱落酸反应元件)和2 × ABRC（两个串联重复的脱落酸反应元件，再加上大麦HVA22两个拷贝的结合元件），各自与CaMV35S的最小启动子结合，能够诱导转基因烟草中报告基因β-葡萄糖醛酸酶基因(gus)对高盐浓度，脱水，脱落酸的应答表达，证明它们能够作为一种有效的胁迫诱导启动子。

与应用组成性启动子相比，抗病基因工程中应用诱导启动子有明显优势。但单一的病原诱导启动子的诱导因子是有限的，因此将不同的病原物诱导因子串联构建在同一植物的表达载体中，可增加诱导因子，扩大转基因植物的抗病谱。从烟草中克隆得到EAS4和hsr203J 两个病原诱导启动子，串联两个启动子置于表达载体p2301NG的gus基因前，转入烟草得转基因植株。结果发现，正常生长情况下转基因烟草检测不到GUS活性或活性极低；但当受Ralstonia solanacarum的菌悬液和疫霉激发子parasiticein、Phytophthora  nicotianea[0]的孢子悬浮液诱导后，转基因烟草叶片中可检测到明显的GUS活性。结果表明，双病原物诱导启动子具有良好的诱导活性，并可进行植物遗传转化。