[发明专利]一种产虾青素基因工程菌的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体地说，是关于一种产虾青素基因工程菌的构建方法。

背景技术

迄今为止，已报道了600多种类胡萝卜素，来源细菌，藻类，酵母和植物兼有，虾青素是其中之一。虾青素的化学全称为3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β’-胡萝卜素，结构式为：

虾青素作为目前最有效的天然着色剂，在食品、纺织行业有着广泛的应用。此外虾青素还是一种极其有效的抗氧化物质，可以保护细胞免于自由基的损伤，由于有着良好的抗癌、增强机体免疫力和抗衰老等重要作用，而倍受医药、保健和化妆品行业关注。

目前生产虾青素的方法主要有化学合成法和微生物发酵法。上世纪80年代，F.Hoffmann-La Roche公司首次完成了虾青素的的化学合成，并成功商品化，但是化学合成工艺较为复杂，同时设备要求比较高，成本较高，并且与天然虾青素相比存在产品结构单一的缺点，导致化学合成生产的虾青素日益遭到消费者的警惕，并开始受到部分国家的立法限制。目前微生物发酵生产虾青素的来源主要是雨生红球藻和红发夫酵母，发酵工艺成熟，并且都成功实现了工业化生产，雨生红球藻的虾青素含量可高达细胞干重的2.0％，而红发夫酵母所产类胡萝卜素中虾青素所占比例可高达85%。与化学合成法相比，微生物发酵法由于其工艺简单，绿色环保，工业生产成本低，产品质量好而愈受各生产公司的青睐。但是雨生红球藻和红发夫酵母均因其菌株自身特性而在一定程度上限制了其进一步的发展以及生产优化，寻找更优良的虾青素生产菌株成为了越来越多研究者的追求目标。

模式菌如大肠杆菌、酿酒酵母等已经被证明是良好的基因工程菌宿主。目前，研究者已经鉴定了包括雨生红球藻，红发夫酵母在内的多种微生物的虾青素合成途径。

酵母的同源重组效率远远高于细菌或是其他的高等真核生物，酵母已作为一种工程菌操作平台，在途径工程和代谢工程领域被广泛用于生物化学途径的异源表达，同时染色体重组获得工程菌，具有遗传稳定，避免外源基因丢失的优点。

Ken等使用酿酒酵母作为宿主菌，构建包含虾青素表达所需基因的多个质粒，然后导入宿主菌并生产虾青素（Ken Ukibe,Keisuke Hashida,Nobuyuki Yoshida,and Hiroshi Takagi.Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for Astaxanthin Production and Oxidative Stress Tolerance.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，2009:7205-7211）。然而，这种虾青素基因工程菌构建的方法需要依次将虾青素表达相关的基因整合于酵母菌染色体上，涉及多级克隆，且依赖于合适的酶切位点选择，操作繁琐，周期长。

发明内容

本研究是基于红发夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）的类胡萝卜素合成途径，以及来源于Brevundimonas sp.和Nostoc punctiforme虾青素合成的相关基因，以酿酒酵母为宿主菌，构建了产虾青素基因工程菌。

本发明旨在提供一种产虾青素基因工程菌的构建方法。

本发明的产虾青素基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

A）构建基因表达模块，所述基因表达模块包括虾青素生产相关的基因、所述虾青素生产相关的基因上游的启动子和所述虾青素生产相关的基因下游的终止子；

B）将所述基因表达模块共转化至酿酒酵母中。

根据本发明，所述步骤A）中所述基因表达模块还包括抗性基因、所述抗性基因上游的启动子和所述抗性基因下游的终止子。

根据本发明，所述步骤A）中所述构建基因表达模块包括以下步骤：

A1）通过PCR扩增获得所述虾青素生产相关的基因、所述抗性基因片段、所述虾青素生产相关的基因上游的启动子片段、所述抗性基因上游的启动子片段、所述虾青素生产相关的基因下游的终止子片段和所述抗性基因下游的终止子片段；

A2）以所述虾青素生产相关的基因、所述抗性基因片段、所述虾青素生产相关的基因上游的启动子片段、所述抗性基因上游的启动子片段、所述虾青素生产相关的基因下游的终止子片段和所述抗性基因下游的终止子片段为模板，通过重叠PCR扩增获得基因表达模块。