[发明专利]一种植酸酶及其重组表达工程菌株

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种植酸酶及其重组表达工程菌株。 

背景技术

植酸酶（Phytase）即肌醇六磷酸水解酶（Myo-i-nositol hexaphosphate phosphohydrotase），是催化植酸以及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称（黄遵锡，1999，食品与发酵工业）。植酸酶是一种糖蛋白，在植物、反刍动物、许多微生物包括酵母、霉菌、细菌中都能产生植酸酶。它能够解除动物植物性饲料中植酸的抗营养作用，提高植物性饲料的营养价值。 

植酸酶作为一种新型饲料添加剂，在动物生产以及在环境保护中，都有重要的应用价值。然而植酸酶在天然材料中表达水平较低，加之天然植酸酶的某些生物学特性（如热稳定性，抗蛋白酶特性等）不能完全适合饲料加工的要求。随着生物技术的飞速发展，采用基因工程的手段，使酶的高产优质成为可能，成为酸酶研究的热点。 

发明内容

本发明的目的是提供一种植酸酶及其重组表达工程菌，通过构建含有植酸酶基因的表达载体，转入黑曲霉（Aspergillus niger）中，获得高效表达该植酸酶的黑曲霉工程菌株。本发明重组表达的植酸酶可广泛应用于饲料领域，能有效提高养殖动物的生产性能和对磷的吸收能力，从而减少磷的排放量，增加养殖效益。 

本发明的植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。 

用于编码上述植酸酶的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。 

本发明涉及一种黑曲霉工程菌,为黑曲霉LH-1（Aspergillus niger LH-1），该工程菌携带有能表达黑曲霉植酸酶基因的表达载体，已于2012年12月5日，保藏于位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO: M 2012502。 

本发明另一方面涉及上述黑曲霉工程菌的应用，用于生产植酸酶。 

本发明另一方面涉及上述植酸酶在饲料中的应用。 

本发明构建的黑曲霉工程菌能高效表达植酸酶，摇瓶发酵酶活为280U/mL。本发明重组表达的植酸酶能有效提高肉鸡生产性能。在日粮中添加本发明重组表达的植酸酶，肉鸡各期平均日增重、料肉比都优于对照组，并且优于国外某 植酸酶产品。本发明的植酸酶能提高肉鸡对磷的吸收能力，使磷的排泄量降低10.7%以上，从而有利于增加养殖效益。 

附图说明

图1：pVL-phy质粒图谱。 

图2：黑曲霉工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指处即为重组表达的植酸酶。 

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。 

实施例1  黑曲霉植酸酶基因的克隆 

1.1 提取黑曲霉的总基因组DNA 

将黑曲霉过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS); 然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μL10M NH ₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000 rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。 

1.2 基因克隆 

以1.1中提取的基因组总DNA为模板，利用如下的引物对进行扩增，引物对的上下游引物序列如下： 

上游引物序列为：GCTCTAGAATGGGCGTCTCTGCTGTTCTA； 

下游引物为：GCTCTAGACTAAGCAAAACACTCCGCCCAATCA； 

PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。经北京华大基因研究中心测序分析，扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:3第45-146位是内含子，去掉该内含子的cDNA序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。