[发明专利]蝙蝠蛾拟青霉中麦角甾醇的免疫活性研究

说明书

技术领域：

本发明公开了蝙蝠蛾拟青霉中麦角甾醇的免疫活性研究，并采用刀豆蛋白A（ConA）诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验和小鼠碳廓清实验的方法对其进行免疫功能检验，研究结果表明蝙蝠蛾拟青霉中麦角甾醇具有对离体T淋巴细胞的抑制作用，并能明显增强小鼠体内单核吞噬细胞的吞噬功能，对小鼠整体具有增强免疫力的作用。该研究属于菌物生药在医药与保健品领域的应用方法，对于蝙蝠蛾拟青霉的保健品食品的开发提供了一定的研究基础，并对未来麦角甾醇所要开发的新型产品提供了一定的理论基础。

背景技术：

蝙蝠蛾拟青霉是天然冬虫夏草分离得到无性型菌株，经发酵培养，所得菌丝体的作用与天然冬虫夏草相似。蝙蝠蛾拟青霉中含有丰富的糖类、蛋白质、甾体化合物、脂肪酸、萜类化合物等。其中，麦角甾醇作为甾体化合物的1种，为真菌类的特征甾醇，却很少受到关注。本文采采用刀豆蛋白A（ConA）诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验和小鼠碳廓清实验的方法进行免疫功能检验，进而来验证麦角甾醇的增强免疫活性。

发明内容：

本发明公开了蝙蝠蛾拟青霉中麦角甾醇的免疫活性的研究，，方法与结果如下：

1、实验方法（常规试验方法）

（1）淋巴细胞转化试验  

样品溶液制备  精密称取样品，30% DMSO溶解，完全培养液稀释至100μg/ml，以0.22μm滤膜过滤除菌，完全培养液稀释至所需浓度。

取BALB/C 小鼠，颈椎脱臼法处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，Hank’s液洗2次（离心1000rpm，5min），置于RPMI 1640完全培养液中，计数，将细胞稀释成浓度为2×10⁶的细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔100μl，每组3个复孔，同时设阴性对照孔、阳性对照孔及空白孔。试验孔加入100μl不同浓度的样品溶液，阴性对照孔及空白孔加入培养液，阳性对照孔加入10μg/ml ConA 100μl。37℃，5% CO2孵箱中培养48h，加入5mg/ml MTT溶液20μl，继续培养4h，终止反应。取出培养板，小心吸去上清液，加入150μl DMSO，充分溶解结晶，酶标仪490nm测定各孔OD值。 结果用转化率表示，计算公式如下：  

转化率 =（样品孔OD值－空白孔OD值）/（对照孔OD值－空白孔OD值）×100%。

（2）小鼠碳廓清实验

将小鼠分为对照组，低剂量组，高剂量组，分别灌服生理盐水，5mg/kg/d麦角甾醇，10mg/kg/d麦角甾醇。每天1次，连续15天。于末次给药1 h后, 各组小鼠按体重每0.1ml/10g尾静脉注射5倍量稀释的印度墨汁生理盐水液，于注射墨汁后2min及10min, 用毛细玻璃管从小鼠眼眶后静脉丛取血20μl,之后将其立即加入2ml的0.1% Na2CO3溶液中, 摇匀, 于分光光度计600 nm波长处测吸光度(OD ) 值, 以Na2CO3溶液作为空白对照溶液。之后将小鼠处死，取脾脏和肝脏，用滤纸吸取脏器表面的血污，分别称重并记录。

廓清指数:K = ( logOD 2 - logOD10) / ( t10 - t2 )

吞噬指数:a=体重/（肝重+脾重）׳√K

实验数据用 表示，并采用SPSS18.0 for Windows统计软件进行分析。P＜0.05说明在统计学上呈显著差异，P＜0.01说明在统计学上呈极显著差异。

2.结果与分析

（1）麦角甾醇对小鼠淋巴细胞转化作用的影响见表1

表1  麦角甾醇对小鼠淋巴细胞转化作用的影响（，n=6）

注：与对照组比较  * p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001   

（2）  小鼠碳廓清实验结果见表2 

表2  麦角甾醇对小鼠吞噬指数的影响

研究结果表明，淋巴细胞转化实验数据表明，麦角甾醇对离体小鼠淋巴细胞转化具有抑制作用，浓度为50 μg/ml 时抑制率达85%，与对照组比较有极显著性差异（p<0.001）。在浓度较低时，浓度与抑制作用具有量效关系，但当浓度达到一定限度，抑制作用大大加强（如附图1为麦角甾醇对小鼠淋巴细胞转化作用的影响图）。碳廓清实验结果表明, 药物作用后小鼠的吞噬指数显著增加, 即单核吞噬细胞功能明显增强，麦角甾醇高低剂量组的吞噬指数分别达到6.429和7.300，都与对照组有极显著差异（P＜0.01），有文献记载麦角甾醇对离体巨噬细胞功能的作用不是很明显，但通过整体实验还是有效果显著。由此可见，蝙蝠蛾拟青霉中麦角甾醇对离体T淋巴细胞具有抑制作用，也能明显增强小鼠体内单核吞噬细胞的吞噬功能，对小鼠整体具有增强免疫力的作用。为蝙蝠蛾拟青霉的保健品食品的开发提供了一定的研究基础，对未来含有麦角甾醇的新型产品的开发提供了一定的理论基础。