[发明专利]一种检测 TUBB3 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测 TUBB3 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法。

背景技术

抗微管类药物是一类以细胞微管蛋白为作用靶点的药物。通过作用于细胞微管而影响纺锤体形成，并抑制细胞有丝分裂的一类广谱化疗药。目前常用的抗微管类药物主要有：紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱和长春瑞滨等。紫杉醇/多西他赛作用于肿瘤细胞后，可以促进肿瘤细胞内的微管聚合以及稳定已聚合的微管，导致细胞内大量微管聚集，进而干扰细胞各种功能，特别是使细胞停止分裂。长春碱/长春新碱等可以抑制肿瘤细胞内微管蛋白的聚合、抑制纺锤体微管的形成，使核分裂停滞于细胞分裂中期，从而抑制肿瘤细胞生长。

微管蛋白α和微管蛋白β构成的α，β异二聚体是微管装配的基本单位，也是许多抗微管类药物的作用靶点。其中TUBB3编码的β-tubulin-Ⅲ（Ⅲ型微管蛋白）与抗微管类药物的疗效关系最为密切。

多种肿瘤细胞系的研究及大量临床试验结果均显示TUBB3 mRNA的表达水平与抗微管类药物的疗效密切相关 (Pascal S and Charles D. Lancet Oncol. 2008;9:168-75.) 。低表达患者接受紫杉醇类或长春碱类化疗的效果较好，中位生存期较长。而TUBB3高表达的患者的抗微管类化疗疗效较差 (Pascal S and Charles D. Lancet Oncol. 2008;9:168-75.) 。

荧光定量PCR技术的出现，为本发明提供了一种操作简单快速、易标准化、检测费用低，准确可靠、定量检测mRNA的方法。通过该方法可以快速检测肿瘤细胞 (来源于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等) 中TUBB3 mRNA的表达量，用于临床医生对抗微管类的合理化使用。

发明内容

本发明旨在提供一种检测 TUBB3 基因mRNA表达量的荧光定量PCR检测试剂盒，能简单快速、准确可靠的检测TUBB3基因。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种检测TUBB3基因表达量的荧光定量PCR试剂盒，包含以下组成部分：

（1）TUBB3基因标准品：含有TUBB3基因编码序列的重组载体，所述TUBB3基因编码序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）检测TUBB3基因的上、下游引物：

TUBB3-上游引物：5’- GGCCTCTTCTCACAAGTACG -3’（SEQ ID NO.2）

TUBB3-下游引物：5’- GAAGAGATGTCCAAAGGCCC -3’（SEQ ID NO.3）

进一步，所述含有TUBB3基因编码序列的重组载体的空载体为pUC57载体；

进一步，该试剂盒还包含逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。

所述逆转录缓冲液为常规逆转录缓冲液，如5×逆转录缓冲液 (有浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的KCl、浓度为4 mmol/L的MgCl2和浓度为10mmol/L的二硫苏糖醇DTT组成) 等；所述逆转录引物 Oligo-(dT) 为寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸；所述 dNTPs 溶液为 dATP (脱氧腺苷三磷酸) 的混合水溶液；所述定量 PCR 缓冲液为常规定量 PCR 缓冲液，如5×定量 PCR 缓冲液 (由浓度为10mmol/L，pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L 的 KCl 和浓度为2 mmol/L的 MgCl2 组成) 等。

本发明还提供了基于上述试剂盒检测 TUBB3 mRNA 基因表达量的方法，包括以下步骤：

（1）从待测标本 (肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等) 中提取细胞总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA；

（2）分别将已知拷贝数的TUBB3基因标准品倍比稀释至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10个拷贝数/μl；