[发明专利]宫膜干细胞的规模化生产工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，涉及干细胞的培养扩增及长期保存方法，尤其涉及一种宫膜干细胞的规模化生产工艺。

技术背景

众所周知，干细胞技术是当今生命科学中最热门的技术之一，其研究内容几乎涉及所有生物医学领域，除了在细胞治疗、组织/器官移植和基因治疗中发挥重要作用外，在发育生物学和新药开发等方面也产生重要影响。近几年来干细胞的研究取得了重大突破，1999和2000年，世界最权威的美国《science》杂志连续2年将干细胞和人类基因组计划列为当年的十大科学突破，尤其是在1999年甚至将干细胞研究列于第一位。干细胞具有不可估量的医学价值，引起全世界的广泛关注和研究。

相较于骨髓干细胞的难以获得以及胚胎干细胞的伦理问题、致畸性，子宫内膜干细胞因其来源的广泛，更强的自我更新和增殖能力，无伦理问题等优势正在获得越来越多的关注。研究证实，女性脱落的子宫内膜组织中分离得到的宫内膜干细胞数量为骨髓来源的30倍，增殖能力为普通其他干细胞的100倍，分化潜能也接近胚胎干细胞。同时宫膜干细胞取自女性废弃的月经中，将这些干细胞通过科学的方法储存起来可实现变废为宝。在女性及其家人未来的生命中，发生重大疾病或意外严重伤害时，利用事先储存起来的干细胞去恢复健康甚至挽救生命都是有可能的。

利用宫膜干细胞有望治疗包括糖尿病、帕金森症、退行性细胞或组织疾病等多种疾病，然而一次成功的治疗需要约10⁹个细胞，这意味着分离出的干细胞必须在短时间内经过有效的体外扩增，获得大量高质量的干细胞，方能达到细胞治疗的要求。传统的二维平面扩增宫膜干细胞较难在短时间内得到足够的细胞量，且经多次传代造成干细胞质量下降，而转瓶和生物反应器培养可以获得足够多的细胞数目用于干细胞治疗。

传统的贴壁依赖性细胞的培养采用静止或者转瓶等培养方法，操作复杂，耗费空间及人力。1967年，Van Wezel首次提出了“微载体系统”的概念，为贴壁依赖性细胞的高密度培养提供了思路，并创建了生物反应器微载体培养细胞工艺，使动物细胞培养进入高密度培养阶段。微载体是指由交联葡聚糖或者其他聚合物组成微珠，直径一般在60-200μm之间，适用于贴壁依赖性细胞的生长。使用此类小球为细胞提供贴附面积，通过轻轻搅拌使载体悬浮于培养液中，细胞也成为了悬浮状态，这种培养方式被称为微载体培养技术。

由于微载体本身所占体积和质量不大，但有很大的有效面积可供细胞附着，大大提高了生产效率。比如5mg Cytodex 1表面积能达到30cm2/mL，而传统的单层培养难以达到如此高的表面积/容积比。1L微载体培养生产的细胞相当于50个转瓶所生产的细胞。这种培养方式对劳动力的需求也下降了许多：省却了玻璃容器等的清洗和准备工作；细胞与培养液的分离简单，一旦搅拌停止，3分钟后细胞即能依靠其重力而沉降，无需进行离心操作，减少了复杂的操作步骤。而且，细胞生理活性培养参数等容易控制，污染概率也大大降低。

动物细胞体外大规模培养主要包括分批培养、灌注培养和补料分批培养模式。

分批培养模式，其特征在于将牙髓干细胞和培养液一次性装入生物反应器内进行培养，细胞不断生长，得到大量扩增，经过一段时间之后，将这个反应系统取出，消化得到高质量的牙髓干细胞。

连续灌注式生物反应器是在细胞培养生物反应器系统中安装细胞微载体截留装置，将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养。一方面新鲜培养液不断加入反应器内；另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。连续灌注式生物反应器可以对细胞的微环境进行更为精确的监测和控制，既省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，培养细胞的密度及质量可以得到很大提高。

补料分批培养是介于分批培养和连续培养之间的培养方法。在细胞培养过程中，随着营养物质消耗，间歇或连续地添加营养成分或新鲜培养基，但不同时收获培养液。

干细胞临床治疗需要大量高活性的干细胞，所以如何在体外短期内培养足够数量的高质量的治疗用细胞以及提供一个规模化、标准化、系统化的细胞储存系统成为了学术界和产业界密切关注的焦点。

本发明针对现有作为种子细胞的宫膜干细胞的快速获取、扩增与长期保存困难等问题，目的在于寻找一种更为高效的培养扩增及长期保存方法，使宫膜干细胞的制备达到规模化的程度。

发明概述

本发明公开了一种宫膜干细胞规模化生产工艺方法。

本发明提供的宫膜干细胞规模化生产工艺方法包括以下步骤：