[发明专利]源于里氏木霉的强启动子及其表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种真菌蛋白表达的强启动子，尤其涉及从里氏木霉中分离、克隆得到的强启动子，还涉及包含有该强启动子和终止子的质粒载体及含有该质粒载体的转化子，以及他们在里氏木霉中蛋白同源或异源表达、基因定位方面的应用,本发明属于源于里氏木霉中启动子的分离与应用领域。

背景技术

里氏木霉（Trichoderma reesei）是一种广泛存在自然界的嗜温腐生真菌，可以分泌多种酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶以及蛋白酶和淀粉酶，尤其是纤维素酶含量很高，分泌的纤维素酶多年来已广泛应用于饲料、制糖、化纤、造纸，等行业中（Feed Industry，2003,24(1)）。近年来，随着能源危机的出现，利用生物质纤维素生产生物乙醇燃料是目前解决燃料危机的有效方式之一。

纤维素酶是由葡萄糖内切酶（EC.3.2.1.4，）葡萄糖外切酶（EC.3.2.1.91）和β-葡萄糖苷酶（EC.3.2.1.2）三种主要成分组成的诱导性复合酶系。在里氏木霉所产生的纤维素酶中，内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶的比例相对较高，而β-葡萄糖苷酶的比例极低。在实际生产中，生物质纤维素的降解最终是由β-葡萄糖苷酶水解纤维素降解过程中释放的纤维二糖降解成葡萄糖，从而去除其对另外两种纤维素酶组成部分的阻遏作用，是纤维素水解过程中的最后一步，也是最关键的限制因素。但里氏木霉中β-葡萄糖苷酶活低成为大规模工业化生产纤维素酶的瓶颈因素。提高里氏木霉中的β-葡萄糖苷酶的活力成为整体提高里氏木霉纤维素酶活力以及其水解能力的关键。里氏木霉中β-葡萄糖苷酶基因的稳定高效表达进而提高酶活，已成为各国研究人员努力公关的项目之一。针对上述问题，一些研究人员致力于传统方式的菌种改造上，通常采用诱变育种方式获得高产菌株，来提高β-葡萄糖苷酶的酶活，虽然也取得了一定的进展（乐易林等，2005；张秋卓等，2009；韩承业等，2010；覃玲灵，2011），但该方式得到的菌株常存在菌种退化、突变问题，而且筛选工作量大，周期长，诱变菌株在生产中并没有得到很好的应用。

目前对于里氏木霉的研究主要集中在基因的诱导表达获得目的产物上，尤其是在各种分泌性目的蛋白类，对于菌种本身的研究较少。基因诱导表达中，最重要的工作是基因表达的第一阶段即转录过程，转录的“开关”启动子决定转录的起始位点，基因表达的程度，在里氏木霉中，广泛使用编码外切葡聚糖酶的基因cbh1的启动子，应用该启动子可提高目的基因的表达量，也可提高某种纤维素酶组分的产量（T Liu et al.2008,Z Rahman et al.2009,J Zhang et al.2010,O Ribeiro et al.2010,Y Zhong et al.2011,L Ma et al.2011,LN Qin et al.2012），但cbh1启动子是一个诱导型的启动子，必须在诱导条件下才能强启动目的基因的表达，另外，该启动子与里氏木霉中其他参与纤维素酶调控的转录因子存在相互作用。因此，采用cbh1启动子往往并不一定能高效表达目的基因，因此找到一种能够高强度并稳定表达的强启动子尤为重要。

发明内容

鉴于上述状况，本发明目的之一在于提供一种从里氏木霉（Trichoderma reesei）中所分离、克隆的强启动子RPL。

本发明的另一目的在于构建一种含有该强启动子RPL和与其对应的终止子的质粒载体及其包含该质粒载体的任何转化子。

本发明的目的之三是将含有该强启动子RPL和与其对应的终止子的质粒载体应用于里氏木霉中控制蛋白在体内的强烈表达，以及应用于关键目的基因的定位。

为实现上述目的，本发明一方面提供了一种从里氏木霉（Trichoderma reesei）中所分离、克隆的强启动子RPL，其多核苷酸序列为（a）或（b）所示:

（a）、SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；

（b）、与SEQ ID NO:1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有启动子的功能或活性。

优选的，本发明所述的从里氏木霉（Trichoderma reesei）中所分离强启动子为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列。