[发明专利]介导膜稳定CD40L基因的衣壳蛋白突变的双链重组腺相关病毒制备方法与应用

权利要求书

1.一种人源膜稳定突变基因CD40L-M，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No：1。

2.根据权利要求1所述的人源膜稳定的突变基因CD40L-M，其特征在于：

CD40L-M基因所编码的氨基酸序列与GenBank报道的人CD40L的氨基酸序列相比具有如下突变：第114位氨基酸由Gln变成Pro，第115位氨基酸由Lys变成Arg，第117位氨基酸由Asp变成Glu，第118位氨基酸由Gln变成Glu，第119位氨基酸由Asn变成Asp。

3.一种质粒载体pdsAAV-CB-CD40L-M，其特征在于：它包含CD40L-M基因。

4.权利要求3所述的质粒载体pdsAAV-CB-CD40L-M的构建方法，其特征在于：

在源克隆pcDNA3.1⁺-CD40L-WT的目的基因片段中通过特异引物设计、高保真DNA聚合酶PCR扩增、自身连接处理引入点突变，再通过亚克隆，得到pdsAAV-CB-CD40L-M质粒载体。

5.一种重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M，其特征在于：它包含CD40L-M基因。

6.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M，其特征在于：所述重组腺相关病毒的载体是从不同血清型的自身互补的双链腺相关病毒scAAV野生体和突变体中遴选出的，外壳蛋白719位点酪氨酸残基点突变为苯丙氨酸的自身互补的重组AAV2/5载体。

7.权利要求5或6所述的重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M，已保藏于中国典型物保藏中心，保藏日期2012年11月26，保藏编号：CCTCC NO：V201252分类命名：介导膜稳定CD40L基因的衣壳蛋白突变的重组双链腺相关病毒。

8.权利要求5所述的重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M的制备方法，其特征在于：采用三质粒共转染法包装腺相关病毒，经纯化、浓缩后，Slot-blot测定病毒滴度，AAV包装时，通过选择不同的野生型或外壳蛋白突变型AAV的pAAV-R/C，及现有的pdsAAV-GFP和pHelper辅助质粒包装成scAAVX-R/C-GFP病毒颗粒，从不同的血清型scAAV野生型和突变型载体中，通过转导肺癌细胞GFP基因的表达效率，遴选出转导肺癌细胞效率最高的载体scAAV2/5-Y719F-GFP，再以三质粒pAAV2/5-Y719F-R/C、pdsAAV-CB-CD40L-M、pHelper共转染法，构建得到scAAV2/5-Y719F-CD40L-M。

9.权利要求5所述的重组腺相关病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M在制备治疗肺癌药物中的应用。